受金属硫蛋白启发的单原子纳米酶不对称杂原子掺杂技术在多酶生物催化中的应用

《Advanced Science》：Metallothionein-Inspired Asymmetric Heteroatom Doping of Single-Atom Nanozymes for Multi-Enzyme Biocatalysis

本研究采用金属硫蛋白启发策略，通过硫掺杂构建不对称Fe单原子催化剂FeN3S，显著提升其多酶模拟活性（1.35-4.60倍），并成功应用于高效抗癌治疗，实现肿瘤细胞抑制率超90%。

　　单原子催化剂（SACs）因其类似酶的活性而受到广泛关注，但其催化效率和功能通常受到单一酶样性能的限制。本文提出了一种基于金属硫蛋白的异原子掺杂策略，成功构建了具有不对称结构的FeN?S单原子催化剂，表现出显著增强的多酶活性，包括NADH氧化酶、氧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶等。Fe3?通过强巯基键与半胱氨酸结合，随后在沸石咪唑骨架-8（ZIF-8）的生物矿化和高温热解过程中，形成稳定的FeN?S结构。该催化剂在一天内即可诱导约90%的肿瘤细胞死亡，展现出其在癌症治疗中的巨大潜力。这项研究为单原子催化剂向多功能生物催化和生物医学应用的发展提供了重要的生物启发策略。

自然酶因其卓越的催化效率和底物特异性，被广泛应用于生物催化、医学和工业领域。然而，它们的实际应用常常受到结构不稳定、对温度和pH值敏感、耐受性差以及高生产成本等限制。为克服这些缺点，纳米酶——具有类似酶活性的纳米材料——逐渐成为研究热点。与天然酶相比，纳米酶具有更高的稳定性和更低的制造成本，但其催化活性和选择性通常不如天然酶。此外，纳米酶的潜在细胞毒性仍然是一个值得关注的问题。单原子催化剂（SACs）作为新兴的纳米酶，显示出优异的结构稳定性、高催化活性和选择性，这得益于其原子级分散的活性位点、可调节的配位环境和金属的高利用率。因此，SACs在生物传感、疾病治疗、环境修复和能量转换等众多领域展现出广阔的应用前景。

尽管SACs展现出优异的性能，但其催化效率和功能仍有提升空间。已有多种策略被探索，如构建多孔结构以提高底物传质效率、引入异原子（如N、S、P、B）以调节金属中心的电子结构、以及通过优化载体和金属-载体相互作用来增强活性位点的稳定性。然而，这些方法也带来了挑战，如结构稳定性下降、活性位点的均匀性受损、高金属负载下的团聚现象，以及限制单一酶样活性的问题。特别是，以往的异原子掺杂策略主要依赖于含异原子的聚合物或小分子，这些材料缺乏对金属离子的特定锚定位点，并且依赖于热解过程中主客体自调节机制，这往往导致金属与非金属原子之间的协调性较差或异原子掺杂过量而缺乏设计。因此，开发一种能够模拟多种酶活性并保持高催化效率的单原子催化剂仍然是该领域的关键挑战。

为了实现这一目标，研究团队采用了一种基于金属硫蛋白的异原子掺杂策略，设计了具有不对称结构的Fe SACs。这一策略借鉴了金属硫蛋白中金属阳离子积累的机制。与其他含硫配体（如1,2-乙二硫醇、1-丁硫醇和硫代甘油酸）相比，L-半胱氨酸甲酯盐酸盐（Cys）不仅能够通过强巯基键与Fe3?离子形成稳定的配位，其氨基还能促进前核化簇的组装，从而有利于ZIF-8框架的形成。这一策略使得Fe3?与Cys的复合物能够高度分散并有效固定在MOF框架内。随后的热解过程生成了不对称的FeN?S SACs，展现出显著的多酶活性，包括NADH氧化酶、氧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的类似活性，其催化效率比不含硫的FeN? SACs提高了1.35–4.60倍。该催化剂的高效多酶活性归因于三个关键因素：i）通过生物矿化形成的高度分散的Fe单原子；ii）保留自原始金属有机框架的高表面积和孔体积；iii）通过Fe与S之间的强巯基配位实现的硫掺杂。硫掺杂不仅调节了Fe单原子的电子结构，降低了活化能并增强了底物相互作用，还促进了电荷转移。最终，FeN?S表现出强大的多酶活性，能够在一天内诱导约90%的肿瘤细胞死亡，这为癌症治疗提供了新的思路。

FeN?S催化剂的结构和性能通过多种实验手段进行了深入研究。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，所有未热解的MOF样品均呈现均匀的十二面体形态，而FeN?S样品由于高温热解表现出粗糙的表面结构。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察，Cys（红色）在ZIF-8纳米晶体中均匀分布，表明Fe–Cys复合物被封装在ZIF-8框架内，而不是吸附在表面。粉末X射线衍射（PXRD）模式显示，Cys-ZIF-8、Fe3?-ZIF-8和Fe3?-Cys-ZIF-8的特征峰与纯ZIF-8一致，确认了Fe3?和Cys在封装后的结构保持。此外，热解后的FeN?S样品保持了与原始MOF一致的形态和粒径，表明结构在热解过程中得到了良好保留。然而，当热解温度进一步升高至900°C时，FeN?S和FeN?样品的粒径略有减小，这可能与有机配体的分解和Zn的挥发有关。这些结果与透射电子显微镜（TEM）图像一致，显示了FeN?S样品中高度分散的金属单原子位点。

X射线光电子能谱（XPS）测量表明，所有样品均含有C、O、N和Zn元素。在ZIF-8及其衍生样品的N 1s XPS谱中，观察到主要峰位于398.5 eV，对应于HmIm中的C≡N键。热解后，FeN?S样品出现了三个主要峰，分别对应于吡啶氮、吡咯氮和石墨氮，表明其电子结构被硫掺杂显著调制。吡啶氮作为单金属原子的主要锚定位点，而吡咯氮和石墨氮则调节了碳材料的电子结构，从而增强了SACs的催化活性。高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）图像显示，FeN?S样品中金属单原子以明亮的点状分布，表明其高度分散的特性。能量色散X射线光谱（EDS）进一步证实了Fe、Zn、C、N和S元素在FeN?S中的均匀分布，表明Fe原子的掺杂和S的引入成功。

为了进一步理解FeN?S的多酶活性机制，研究团队采用X射线吸收精细结构光谱（XAS）分析了Fe SACs的化学状态和配位环境。Fe K-edge XANES谱显示，FeN?S的Fe K边近边吸收能量介于FePc和Fe?O?之间，表明Fe的主要价态在+2至+3之间。通过XANES谱的线性组合拟合，计算出FeN?S中Fe的氧化态为+2.22，而FeN?中为+2.03，这表明FeN?S中Fe的氧化态略高于FeN?。此外，Fe K-edge FT-EXAFS谱显示，FeN?S的Fe–N键长为1.997 ?，比FeN?的2.008 ?略短，这表明硫掺杂导致了Fe–N键的微小调整，进而优化了配位环境。定量FT-EXAFS曲线拟合分析表明，FeN?S的Fe–N配位数为3.4，Fe–S配位数为1.1，而FeN?的Fe–N配位数为3.3，Fe–S配位数为0，这进一步证实了硫掺杂对Fe配位环境的调制作用。这些结果表明，FeN?S的异构配位结构有助于其多酶活性的增强。

为了评估FeN?S的多酶活性，研究团队进行了NOX、OXD、POD和CAT等催化活性的实验。NOX-like活性通过NADH氧化反应进行评估，使用分光光度计在340 nm处监测反应进程。所有NADH氧化反应均遵循米氏动力学，FeN?S的催化效率（Kcat/Km）为267.42 μM?1h?1，而FeN?为65.99 μM?1h?1，表明FeN?S的催化效率提高了4.1倍。在热解温度为900°C时，FeN?S-900和FeN?-900的催化效率显著降低，FeN?S-900甚至表现出低于FeN?-900的活性，这表明热解温度对Fe SACs的性能具有显著影响。相比之下，不含Fe单原子的对照样品NC、NC-900、SNC和SNC-900仅表现出极低的催化效率（约4–6 μM?1h?1），进一步证明Fe单原子对NOX-like活性至关重要。OXD-like活性通过3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）比色法评估，FeN?S的催化效率为65.71 μM?1h?1，比FeN?提高了4.6倍。然而，当热解温度升高至900°C时，FeN?S-900和FeN?-900的OXD-like活性显著下降，FeN?S-900仅比FeN?-900高1.35倍。这表明热解温度对OXD-like活性具有重要影响。POD-like活性通过邻苯二酚（TA）荧光检测评估，FeN?S表现出比FeN?高约2倍的活性。此外，FeN?S在高浓度H?O?下表现出更强的·OH生成能力，表明其在POD-like反应中具有更高的催化效率。CAT-like活性通过[Ru(bpy)?]2?荧光检测评估，FeN?S表现出比FeN?高1.35倍的O?生成能力，表明其在CAT-like反应中具有更高的催化活性。这些实验结果表明，FeN?S的多酶活性显著高于FeN?，其性能主要归因于硫掺杂对Fe单原子的电子结构调制，以及MOF衍生碳结构和Fe单原子之间的协同作用。

为了进一步揭示FeN?S的多酶活性机制，研究团队进行了密度泛函理论（DFT）计算。结果表明，硫掺杂显著调制了Fe中心的电子结构，导致其在费米能级附近的态密度（DOS）增加，并形成了新的杂化轨道。此外，硫掺杂使得Fe d带中心向费米能级移动，表明Fe 3d轨道在FeN?S中更加活跃，从而增强了其与反应底物的相互作用和电荷转移效率。这些变化表明，FeN?S的多酶活性主要来源于其异构配位结构和电子结构的调制。此外，电子自旋共振（EPR）光谱显示，FeN?S的Fe活性位点表现出比FeN?更宽的信号峰，这表明FeN?S中的Fe原子具有更高的电子密度，其磁性行为与FeN?不同。这些结果进一步支持了硫掺杂对Fe中心电子结构和磁性的重要调制作用。

为了评估FeN?S的多孔结构对其多酶活性的影响，研究团队对N?吸附-脱附等温线、比表面积和孔径分布进行了分析。结果表明，FeN?S在低温吸附区域表现出典型的微孔材料特征，氮气吸附开始于非常低的相对压力（≈5 × 10?? P/P?），这表明FeN?S中存在内壁超微孔（<1.2 nm）。此外，FeN?S-900和FeN?-900在吸附-脱附等温线中表现出小的滞后环，这表明存在互联的介孔结构。高温热解过程使得FeN?S保留了原始MOF的孔径和比表面积，而900°C热解样品的比表面积和孔体积明显降低，这可能与Zn的蒸发、结构塌陷和石墨化有关。这些变化导致了FeN?S的多孔结构对催化活性的显著影响，表明其高比表面积和孔体积有助于活性位点的暴露和中间体的传输，从而提升了催化性能。

为了评估FeN?S对肿瘤细胞的抑制效果，研究团队进行了体外细胞毒性实验。实验结果表明，FeN?S在40 μg/mL浓度下对4T1细胞表现出最强的抑制作用，其细胞死亡率在24小时内达到约90%。相比之下，FeN?、FeN?S-900和FeN?-900的细胞死亡率较低，表明FeN?S在癌症治疗中具有显著优势。此外，FeN?S对正常细胞（如3T3成纤维细胞）表现出较低的毒性，表明其具有一定的选择性。荧光成像进一步确认了FeN?S对4T1细胞的显著细胞死亡效果。长期稳定性实验表明，FeN?S在24小时和72小时内分别释放了12.2%和12.7%的Fe，以及19.7%和36%的Zn。此外，检测到72小时后释放的S含量为4000 ng/mL，表明其在生物环境中具有一定的稳定性。进一步的实验表明，FeN?S的释放物质对正常细胞的毒性较低，而对肿瘤细胞则表现出显著的细胞毒性。

为了评估FeN?S对肿瘤细胞的细胞死亡状态，研究团队使用了Annexin V-FITC/PI染色方法。结果表明，FeN?S在200 μg/mL浓度下处理24小时后，约41.5%的4T1细胞表现出同时的Annexin V和PI阳性，这表明其处于晚期凋亡或坏死状态。约25%的细胞表现出Annexin V阳性但PI阴性，这表明其处于早期凋亡状态。仅约1%的细胞表现出PI阳性但Annexin V阴性，这表明其主要通过凋亡而非直接坏死诱导细胞死亡。这些结果表明，FeN?S主要通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤细胞生长。

此外，FeN?S的活性位点能够有效产生活性氧（ROS），包括·OH和·O??，这有助于肿瘤细胞的氧化损伤和凋亡信号通路的激活。通过检测细胞内的NADH/NAD?平衡，研究团队发现FeN?S能够显著提高癌细胞中的NAD?含量，从而破坏其氧化还原平衡。同时，FeN?S还能显著增加细胞内的ROS水平，包括·O??和·OH，这表明其在多酶活性方面具有显著优势。进一步的实验表明，FeN?S能够显著抑制癌细胞内的ATP生成，从而破坏其能量代谢。这些结果表明，FeN?S通过其多酶活性和氧化应激诱导，能够有效抑制肿瘤细胞的生长和存活。

综上所述，FeN?S作为一种基于金属硫蛋白的异原子掺杂策略构建的不对称单原子催化剂，不仅具有显著的多酶活性，还表现出强大的肿瘤细胞抑制效果。其高催化效率和选择性使其在生物医学应用中具有巨大潜力。此外，FeN?S的结构设计和合成方法为其他金属单原子催化剂的开发提供了新的思路，表明该策略可以推广到其他金属元素的单原子催化剂设计中。未来，FeN?S的体内应用需要进一步优化其表面特性，例如通过PEG化或使用两性离子聚合物进行包覆，以形成亲水屏障，减少蛋白吸附和免疫识别。此外，FeN?S可以通过修饰为巨噬细胞膜或特定抗体，实现对炎症部位的靶向递送，从而提高其在生物医学中的应用潜力。