克服临床障碍：利用自组装系统突破抗菌肽的蛋白酶限制

《Aggregate》：Overcoming Clinical Barriers: Utilizing Self-Assembly Systems to Break the Protease Limitations of Antimicrobial Peptides

天然抗菌肽（AMPs）因生物活性低、毒性高及稳定性差等问题难以临床应用。本研究通过分子组装策略，设计含1-吡咯丁烷丁酸（Pba）疏水骨架的五肽序列自组装多肽Pba*，证实其GM MIC=2.88（最低抑菌浓度几何均值），GM SI=44.44（选择性指数几何均值），显著优于传统单体肽。Pba*通过自组装形成纳米纤维和微球，增强膜穿透性，破坏细菌膜电位、干扰能量代谢及诱导ROS积累，同时保持低毒性和生物相容性。体内实验显示其安全性和杀菌效果与环丙沙星相当，且无耐药性风险。该研究为开发新型抗菌材料提供理论依据。

　　自然抗菌肽（AMPs）在临床应用中面临诸多挑战，主要源于其生物活性低、毒性高以及稳定性差。为解决这些问题，本研究提出了一种通过分子组装来增强AMPs稳定性的策略，并探讨了新设计的自组装肽相较于单体肽的优势。我们对抗菌活性、生物相容性、体外稳定性以及特别的蛋白酶稳定性进行了系统研究，旨在开发高效且稳定的新型抗菌肽，作为传统抗生素的替代品。通过将不同疏水支架连接到一个抗酶的短肽序列上，构建了一系列具有自组装能力的新型设计肽。其中，以1-芘丁酸（Pba）为疏水支架的自组装设计肽Pba*表现出最高的抗菌活性（GM MIC=2.88）和最大的临床潜力（GM SI=44.44），同时保持了优异的生物相容性和生理稳定性。机制研究表明，Pba*能够自组装成球形胶束和纳米纤维，捕获细菌并破坏细胞膜，干扰呼吸和能量代谢，从而促进细菌死亡。值得注意的是，Pba*在小鼠中表现出极低的毒性，并能有效缓解细菌感染。本研究为开发高效的抗菌材料铺平了道路。

抗菌肽是新型抗菌药物，具有显著的潜力作为对抗多药耐药（MDR）细菌感染的治疗选择。它们是一类小分子活性物质，具有广谱和强效的抗菌特性。除了抗菌作用外，抗菌肽在调节免疫反应和控制炎症方面也发挥重要作用。与传统抗生素不同，抗菌肽主要通过物理破坏细菌细胞膜，导致细胞内容物泄漏，并干扰细菌的代谢过程，从而引发细菌死亡。因此，抗菌肽在诱导耐药性方面表现出较低的倾向。然而，尽管抗菌肽在解决细菌耐药性方面具有潜力，其商业化仍受到一些固有局限性的阻碍，如低生物活性、高毒性以及在血清、生理盐和蛋白酶环境中的稳定性差。这些因素可能导致生物活性的丧失，其中血清蛋白酶稳定性差被认为是其进一步发展的最大障碍。

随着纳米技术和纳米材料的快速发展，各种策略被探索以设计基于肽的自组装抗菌材料，这些材料表现出显著的生物效应和治疗潜力。其中，自组装肽FF能够与细菌膜相互作用，引起渗透、去极化、应激反应调控子系统的上调以及严重的形态损伤，从而抑制细菌生长并诱导其死亡。最近的研究表明，短肽可以通过与金属离子（如银离子）形成纳米杂化物，提高抗菌活性，利用肽自组装和金属离子介导的杀菌机制之间的协同效应。具体而言，自组装肽在抗菌活性和稳定性方面具有显著优势。一方面，自组装肽可以增加AMPs的侧链密度，从而提高其抗菌效果。另一方面，自组装肽能够隐藏容易受到蛋白酶攻击的活性位点，从而减少蛋白酶降解的风险。此前的研究主要集中在单体肽或自组装肽，而对这两类肽在抗菌活性、生理稳定性和多样化杀菌机制方面的综合探索和比较仍然缺乏。因此，进一步研究单体肽和自组装短肽，将有助于开发更加稳定和有效的抗菌材料。

本研究通过设计短肽序列，结合不同的疏水支架，构建了一系列具有自组装能力的新型设计肽。这些设计肽包括单体肽和自组装肽。通过比较单体肽和自组装短肽在生物相容性、生物活性和生理稳定性方面的性能差异，我们旨在开发高效稳定的抗菌材料。研究结果表明，以Pba为疏水支架的短设计肽Pba*在各种复杂环境中表现出优于单体设计肽的稳定性。此外，Pba*通过多种机制抑制细菌生长，从而降低诱导细菌耐药性的可能性。这些发现强调了自组装短设计肽Pba*在临床应用中的巨大潜力，并确立了其在蛋白酶稳定性方面优于单体设计肽的优势。进一步对自组装肽进行深入研究，有望加速其在临床中的应用。

在本研究中，我们系统地探讨了Pba*自组装设计肽的抗菌机制。通过结合荧光探针，我们观察了Pba*在细菌中的作用位点。结果显示，Pba*能够通过静电作用靶向细菌膜上的LPS或LTA，促进其穿透并破坏细胞壁，显著干扰细胞膜电位，加剧细胞膜的破坏，从而导致细胞内容物泄漏，诱导细菌ROS积累，减少ATP合成，加速细菌死亡。在高浓度下，Pba*自组装成纳米纤维，捕获细菌，防止其扩散，同时促进其破坏。这些多样化的杀菌机制对于推进自组装设计肽的临床转化具有重要意义。

此外，我们还评估了Pba*纳米纤维在体内的生物相容性和疗效。通过将Pba*溶液（5、10和20 mg/kg）通过腹腔注射给6-8周龄的健康雌性C57BL/6小鼠，我们评估了其在体内的安全性。在整个实验期间，各组小鼠的整体体重无显著差异，表明Pba*纳米纤维在所测试的浓度下未引起显著的器官毒性。进一步的血液生化指标分析显示，Pba*治疗组与对照组在器官健康方面无显著差异，证明其在体内的安全性良好。组织学检查（H&E染色）显示，Pba*治疗组的肝脏、脾脏和肾脏未出现组织学异常，而心肺组织也未发现异常。这些结果共同表明，Pba*在体内具有良好的安全性。

我们还建立了细菌血症模型，以进一步评估Pba*的治疗潜力。通过将Pba*与传统抗生素环丙沙星进行比较，我们发现Pba*在抑制细菌负荷和减少炎症因子释放方面表现出显著效果。在连续30天的低效抗菌浓度处理后，Pba*的MIC值保持不变，而环丙沙星的MIC值显著增加，表明Pba*在抗耐药性方面具有优势。这些发现表明，Pba*可能成为对抗逐渐失去临床优势的抗生素的一种替代方案。

总之，本研究通过结合不同疏水支架和自组装系统，成功构建了一系列设计肽，并揭示了其在抗菌活性和稳定性方面的显著优势。这些发现不仅为基于肽的纳米材料的开发提供了新的理论基础，还为抗菌肽在临床中的应用提供了解决方案。未来的研究可以借鉴本研究的策略，推动基于肽的纳米材料从实验室走向临床实践。本研究为未来在临床环境中设计和应用基于肽的纳米材料提供了重要的见解。