基于结构的理性设计：一种选择性抑制严重急性呼吸综合征冠状病毒2型Nsp3大结构域的水解酶抑制剂

《ChemBioChem》：Structure-Based Rational Design of a Selective Hydrolase Inhibitor of the Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-2 Nsp3 Macrodomain

高效磷酸生物同源体磺酰亚胺修饰的GS-441524衍生物3通过分子模拟与实验验证，展现出对SARS-CoV-2 Nsp3b巨域的高亲和力（Kd=0.86 μM）及选择性抑制，其磺酰亚胺基团通过氢键网络稳定结合磷酸结合口袋，同时避免磷酸的代谢缺陷与空间位阻问题。该研究为病毒巨域靶向药物设计提供了结构-活性关系新范式及合成优化策略。

　　病毒的宏域（macrodomains）是其逃避宿主免疫系统的重要结构，这些宏域能够识别并水解单-ADP-核糖（MAR）修饰的蛋白质。这种能力使病毒能够在感染过程中干扰宿主的免疫反应，从而促进其生存和传播。近年来，研究人员将目光投向这些宏域，探索其作为抗病毒药物靶点的潜力。然而，由于宏域的结构复杂性和其在病毒中的高度保守性，如何有效设计具有高亲和力和选择性的抑制剂仍是一个挑战。GS-441524，作为抗病毒药物瑞德西韦（remdesivir）的活性代谢产物，已被确认能够抑制SARS-CoV-2（严重急性呼吸系统综合征冠状病毒）的宏域Nsp3b。这一发现为开发新型抗病毒化合物提供了重要的起点。

为了进一步优化GS-441524的结构，研究团队对其进行了系统性的结构-活性关系（SAR）分析，以揭示宏域识别机制中的关键因素。他们测试了一系列基于腺苷的核苷酸类似物和GS-441524的磷酸化衍生物，结果表明，磷酸基团的构型和核苷酸碱基的种类对结合亲和力具有显著影响。特别是，GS-441524的磷酸化衍生物，如其单磷酸（RMP）和三磷酸（RTP）形式，展现出比传统腺苷类化合物更高的结合能力，达到200倍的增强效果。这一显著的提升说明，非天然核苷碱基的引入在优化病毒宏域识别方面具有重要的作用。

在此基础上，研究团队提出了一种新的策略，即使用磺酰胺（sulfamoyl）作为磷酸基团的生物等排体（bioisostere）。磺酰胺不仅能够模仿磷酸基团的几何结构和氢键能力，还具备更好的膜渗透性、代谢稳定性和化学可操作性。通过合成磺酰胺修饰的GS-441524衍生物（化合物3），研究团队验证了这一策略的有效性。化合物3在结合亲和力方面表现出显著优势，其解离常数（K_D）仅为0.86 μM，相较于GS-441524的10 μM和ADPr的6 μM，提升了近十倍的结合能力。这一结果表明，磺酰胺取代在提升亲和力方面具有重要价值。

为了进一步解析化合物3与Nsp3b的结合机制，研究团队采用了多种生物物理技术，包括高分辨率核磁共振（NMR）和等温滴定量热法（ITC）。NMR数据揭示了化合物3在Nsp3b结合口袋中与多个关键残基形成了稳定的氢键网络。具体而言，磺酰胺基团与Val253、Ile335的主链酰胺和Gly334的羰基氧形成了三个氢键，这种相互作用增强了结合稳定性。此外，化合物3的磺酰胺氮原子在生理条件下可能带有正电荷，从而与Phe336的芳香环发生阳离子-π相互作用，这种作用在传统磷酸基团中难以实现。这些结构特征共同构成了化合物3的高亲和力基础。

进一步的实验表明，化合物3在抑制Nsp3b的去单-ADP-核糖化（de-MARylation）活性方面具有显著效果。在与MAR修饰的GST-hPARP10 ART进行结合实验中，化合物3的抑制能力优于GS-441524，并且其对MERS-CoV（中东呼吸综合征冠状病毒）宏域的抑制能力也显示出一定的选择性。然而，值得注意的是，尽管化合物3在体外表现出良好的结合特性，但在细胞层面的抗病毒效果却并不显著。在VeroE6-TMPRSS2细胞中，即使浓度达到40 μM，化合物3对SARS-CoV-2的抑制效果仍未能检测到，而对CHIKV（寨卡病毒）则显示出一定的抑制作用。这一结果提示，尽管化合物3在分子层面具有较高的亲和力，但其在细胞环境中的实际应用仍面临挑战，例如膜渗透性、代谢稳定性或靶点在不同细胞环境中的必要性。

为了解决这一问题，研究团队提出了一系列可能的优化方向。首先，可以通过进一步的结构修饰，提高化合物的细胞渗透性和代谢稳定性。其次，考虑针对病毒宏域中独特的次级结合口袋或动态结构区域，设计更具选择性的抑制剂。此外，基于已知的高亲和力结构，采用片段导向的药物设计策略，可以更高效地筛选出具有更高抑制活性的化合物。这一策略不仅能够提高药物的亲和力，还能减少对宿主蛋白的非特异性结合，从而降低副作用的风险。

研究团队还发现，化合物3在结合不同病毒和宿主宏域时表现出显著的选择性。例如，与SARS-CoV-2的Nsp3b结合时，其K_D值远低于对其他病毒宏域（如MERS-CoV）或宿主宏域（如hMacroD2、CHIKV）的结合能力。这一选择性表明，化合物3在设计时充分考虑了病毒宏域的结构特征，使其能够特异性地与目标蛋白结合。同时，这也为未来开发更广泛的抗病毒药物提供了基础，通过进一步的结构优化，有望拓展其对其他冠状病毒的抑制能力。

此外，研究团队在结构分析中发现，磺酰胺基团的引入不仅提升了化合物的结合能力，还改善了其药代动力学特性。由于磺酰胺的中性或弱碱性特性，其在细胞内的稳定性更高，相较于传统的磷酸基团，更容易穿越细胞膜并维持较高的药物浓度。这些优势使得磺酰胺成为一种有潜力的药物设计策略，特别是在针对病毒宏域的抗病毒药物开发中。

在药物开发的背景下，化合物3的发现不仅为SARS-CoV-2提供了新的研究工具，也为未来开发其他冠状病毒的抑制剂提供了重要的结构基础。研究团队强调，进一步的结构优化和生物活性评估将是推动这一领域发展的关键步骤。通过结合计算化学、结构生物学和药理学方法，有望设计出更高效、更安全的抗病毒药物，从而为治疗多种病毒引起的疾病提供新的选择。

总之，这项研究揭示了磺酰胺作为磷酸基团生物等排体在提升抗病毒药物亲和力和选择性方面的潜力。化合物3的成功合成和表征为开发新型抗病毒药物提供了重要的理论支持和实验依据。尽管其在细胞层面的抗病毒效果仍有待提升，但其结构特性和结合机制为后续的药物优化奠定了坚实的基础。未来的研究可以进一步探索如何通过化学修饰和结构设计，提高化合物的生物活性，使其成为有效的抗病毒药物。这一研究不仅拓展了抗病毒药物的设计思路，也为理解病毒与宿主相互作用的分子机制提供了新的视角。