综述：突破（光学）屏障：光声成像在动脉粥样硬化性疾病中的应用

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Breaking (Light) Barriers: Photoacoustics in Atherosclerotic Diseases

本综述系统阐述了光声成像（PAI）这一新兴技术，其融合高光学对比度与深层组织穿透力，为动脉粥样硬化病变提供了高分辨率的解剖结构、功能参数及分子特征信息。文章详述了PAI的技术原理（如PAM/PAT/IVPAI）、光谱分离技术，并重点探讨了其在评估斑块稳定性（通过内源性造影剂如血红蛋白、脂质、胶原）及应用外源性造影剂方面的最新进展，展望了其在心血管疾病研究与临床转化中的挑战与未来方向。

　　

2 光声成像模式

光声成像（PAI）可根据成像深度和空间分辨率的需求，通过特定的系统设计进行定制，以适应不同的心血管应用场景。两种最常见的实现方式是光声显微镜（PAM）和光声断层扫描（PAT），它们的光学和声学聚焦策略不同。此外，血管内光声成像（IVPAI）作为一种强大的模式已经出现，能够从血管腔内对动脉粥样硬化病变进行高分辨率成像。

当需要高空间分辨率时，PAM是首选。它通过将光紧密聚焦在组织上来实现微观层面的精细成像。PAM可进一步分为两种类型：光学分辨率PAM（OR-PAM），其分辨率取决于光的聚焦精细度；以及声学分辨率PAM（AR-PAM），其聚焦基于声波。OR-PAM可以分辨小至几微米的特征，但成像深度有限，通常小于1毫米。而AR-PAM则牺牲部分分辨率，但能穿透组织数毫米，更适合成像皮肤等结构。这些PAM配置对于监测外周动脉疾病患者的皮肤微血管尤为有用。

对于成像更大的结构或更深的组织层，PAT更为合适。与PAM不同，PAT使用宽光束照射更广的区域。产生的超声信号由围绕组织布置的探测器捕获，通常作为手持式探头或环形阵列的一部分。PAT系统可以穿透组织数厘米，空间分辨率达到亚毫米级，使得采用PAT的系统适合于可视化整个斑块及周围脉管系统。这种方法已在动物模型和早期人体研究中成功应用。由于PAT在深度、分辨率和可扩展性之间取得了平衡，它成为PAI在心血管疾病中许多转化和临床应用的基础。例如，目前有一项使用PAT识别下肢动脉疾病的临床试验正在进行中（NCT06579326）。

在这些非侵入性方法的基础上，IVPAI将PAI直接带入血管内部。IVPAI使用结合激光输送和超声检测的导管式探头，能够从动脉内部产生斑块成分的高分辨率横截面图像。通过从血管内部成像，IVPAI限制了光在组织中的散射，从而能够准确可视化位于血管壁深处数毫米的特征。这使其尤其适用于斑块成像。尽管IVPAI的常规临床应用仍在开发中，但它已显示出巨大的潜力。

3 光谱光声成像

在PAI的所有配置中，最引人注目的优势是能够根据组织成分独特的光学吸收谱来区分它们。内源性发色团，如氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白、脂质和胶原，具有不同的吸收光谱，允许通过用多个波长照射组织并分析相应的声学信号来识别它们。这个过程被称为光谱分离，使得无需标记的分子水平组织表征成为可能，并为结构成像增添了强大的功能维度。

光与生物组织的相互作用给光谱分离带来了重大挑战。散射和波长依赖性吸收（统称为光谱着色）会导致检测到的信号出现深度和波长特异性的失真。这些效应使得发色团浓度的准确定量变得复杂，尤其是在较深的组织区域。虽然传统的线性分离模型因其简单性和可解释性而被广泛使用，但它们假设光通量均匀，并且通常在光学衰减最小的浅表组织中表现最佳。

最近，机器学习和深度学习方法已成为PAI中光谱分离的有前途的替代方案。这些数据驱动的方法旨在直接从数据中学习PA信号与底层发色团分布之间的关系，绕过了显式建模的需要。这种灵活性使它们能够很好地处理生物组织和病理学的复杂性和可变性。

诸如深度学习增强的多光谱光声断层扫描（eMSOT）和基于超像素的分离（SPAX）等方法，在实验和临床前研究中已显示出更高的准确性和鲁棒性。这在传统分离模型往往不足的复杂或深层组织中尤其如此，因为它们无法解释光谱着色。这些数据驱动的方法得益于其捕获非线性关系和适应异质性组织环境的能力。然而，它们的性能仍然与训练数据的质量和多样性密切相关，而这些数据通常仅限于模拟或简化的体模。

为了解决这一局限性并支持持续进展，该领域正日益强调标准化和可重复性。目前正在努力开发能更好地反映体内条件复杂性的、逼真的标准化体模和基准数据集。国际光声标准化联盟（IPASC）在这些发展中发挥着关键作用，它促进统一的协议、经过验证的参考材料和开放的数据共享倡议。这些标准化努力有望加强验证实践，并加速光谱PAI，特别是先进的分离方法，向更广泛的研究和临床应用转化。

4 心血管病理学中的光声成像

当检查动脉粥样硬化病变的复杂组成和易损性时，非侵入性PAI的潜力变得显而易见。影响斑块稳定性的因素，如脂质核心、纤维帽和斑块内出血，具有固有的PA特性。这些内在的PA成分以其强吸收性、独特的光谱以及在近红外一区（NIR-I, 700–900 nm）和近红外二区（NIR-II, 900–2500 nm及以上）窗口的高丰度为特征。以下部分将重点介绍在动脉粥样硬化背景下对已知内源性成分的PAI研究。

4.1 脂质

易损的动脉粥样硬化斑块的经典特征是具有大的脂质核心，其可构成斑块体积的大部分。在体成像脂质积聚有潜力识别有破裂风险的斑块。在PAI中，脂质的吸收光谱有三个 distinct 峰，分别位于大约920、1040和1210 nm附近。这三个峰对应于脂质中丰富的CH₂键的振动倍频。在这些峰中，1210 nm峰的强度最高。此外，血液在该波长下的吸收主要来自水，且相对较低，这使得1210 nm峰特别适用于在NIR-II光谱中使用PAI进行脂质成像。

特别是IVPAI，不受皮肤和周围组织光吸收的挑战，已被用于脂质成像。组织学已证实，在动物模型和人类受试者中，使用IVPAI成功成像了动脉粥样硬化斑块中的脂质沉积。

最近，Sangha等人展示了一种无需血管内成像导管即可在体成像主动脉周围脂肪积聚的方法。他们发现，易患动脉粥样硬化的小鼠比野生型小鼠有更多的主动脉周围脂肪积聚。Karlas等人通过脂质的非侵入性成像证明，他们能够区分颈动脉粥样硬化患者和健康志愿者，显示了临床转化的潜力。

4.2 胶原

薄纤维帽是易损斑块的一个重要特征。胶原作为细胞外基质的主要成分，是动脉粥样硬化中的一个重要成像靶点。胶原的吸收光谱有两个峰，一个在1200 nm，另一个在1450–1470 nm。1180 nm峰很重要，因为水的吸收不干扰，而在1450–1470 nm峰，水是主要的吸收体。

对动脉内膜切除样本的离体PAI已成功识别出斑块内富含胶原的区域。然而，胶原的在体成像仍然具有挑战性。为了解决这个问题，Jansen等人使用IVPAI来区分含有结缔组织的外膜，在人类动脉粥样硬化斑块中揭示了与理论上的弹性蛋白和胶原特征一致的光谱。一个主要的挑战是胶原和脂质的光谱轮廓非常相似，使得可靠地区分它们变得困难。在肝纤维化等其他疾病模型中，使用无偏的光谱分离算法在区分脂质和胶原方面也取得了进展。可以预见，对易损动脉粥样硬化病变关键成分——胶原的在体成像将继续取得进展。

4.3 血红蛋白

不稳定动脉粥样硬化病变的另一个标志是斑块内出血（IPH）。斑块内出血由含有血红蛋白的红细胞组成。血红蛋白在NIR-I区域具有强而独特的光谱PA信号。当与氧气结合时，血红蛋白的电子构型发生变化。这种变化使PA光谱发生位移，导致氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白具有不同的光谱。

IPH的识别已在离体的人类动脉内膜切除标本中得到证实，并通过IPH的组织学分析确认。在体成像动脉粥样硬化斑块更为复杂，因为成像深度和局部条件的影响。Muller等人使用IVPAI在患者中识别出了出血性斑块。组织学分析在检查斑块后证实了IPH的存在。此外，Karlas等人表明，除了上述脂质外，血红蛋白信号也可用于检测动脉粥样硬化病变。

4.4 黑色素

在进行PAI时，考虑黑色素的影响很重要，因为它可能导致肤色较深个体测量结果出现偏差。虽然黑色素不是心血管成像中的直接发色团，但它强烈影响PA信号。较高的黑色素浓度（见于Fitzpatrick肤色较深的人群）会增加皮肤表面的吸收，并减少成像深度，导致与较浅肤色相比不同的结果。Mantri等人证明，由于技术偏差，这会导致深色皮肤的氧饱和度读数较低，但可以使用基于Fitzpatrick皮肤类型的公式进行校正。因此，在进入临床时，应考虑黑色素水平，以避免基于肤色的偏差。

5 外源性光声造影剂

虽然天然吸收的发色团是PA动脉粥样硬化病变成像的基础，但这仅限于固有产生强PA信号的成分。为了克服这一局限性并使能够可视化具有低固有PA对比度的特定细胞类型和生物标志物，外源性PA试剂（如小分子染料、纳米颗粒和微泡）通过特异性靶向这些成分提供了宝贵的机会。

外源性PA试剂具有几个优点，特别是比内源性造影剂更高的PA信号强度、增加的特异性和增强的分辨率。此外，PA造影剂可与其他成像模式（如荧光成像和MRI）兼容，促进多模态成像。

对于实用的外源性PA组分的关键特性存在广泛共识。理想的外源性试剂表现出强吸收、低量子产率和高摩尔消光系数，促进有效的PA信号产生。该试剂必须在NIR范围内具有独特的光谱，允许从组织中提取信号。此外，这些化合物的生物相容性、稳定性和有效清除对于体内使用至关重要。从实际角度来看，试剂合成和修饰的简便性至关重要，包括成本效益。

表1展示了外源性PA试剂的例子，包括小分子染料和纳米颗粒，突出了它们的多样性。如果可用，则包括应用于动脉粥样硬化的试剂；否则，来自其他疾病模型的例子展示了潜在用途。以下部分将涵盖每类试剂的关键特征，如性质、靶向策略和潜在的临床转化，重点是与PAI在动脉粥样硬化中的相关性。

5.1 小分子染料

小分子染料是PAI极具吸引力的试剂。小分子染料是低分子量有机化合物，通常具有明确的化学结构。小分子染料因其强吸光性而被使用。大多数染料毒性低，生物相容性好。此外，小分子染料可以与靶向剂（如抗体、肽或适体）偶联，以实现分子标志物的选择性成像。

最普遍的PA染料之一是吲哚菁绿（ICG）。ICG对白蛋白具有高亲和力，并且是FDA批准的血流造影剂，在临床中用于多种用途。ICG在810 nm处有峰值，兼具PA和荧光特性。许多临床研究已使用ICG进行，因为其荧光特性使其成为荧光引导手术的有用工具。

利用ICG结合PAI，Jonas等人展示了化合物对淋巴引流治疗效果。它还被用于成像肿瘤中的血管通透性。在后一项研究中，PA信号可以在使用常规方法检测到肿瘤生长抑制之前区分对照组和治疗组。ICG也已用于PAI的临床试验中以成像血流。

此外，ICG已与抗体偶联以靶向B7-H3（一种乳腺癌相关的分子靶点）。使用该系统，他们能够准确区分小鼠的乳腺癌和正常乳腺组织。ICG与靶向抗体偶联的简便性提供了一个通用的PA平台。

与ICG类似，IRDye800CW（也称为CW800）已被探索用于光声成像应用，特别是在与抗体偶联时。例如，CW800已与抗表皮生长因子受体（EGFR）抗体偶联，用于检测人类隐匿性淋巴结转移，展示了其分子靶向成像的潜力。这种方法也可能与动脉粥样硬化相关，因为EGFR参与炎症、氧化和增殖信号传导，这些都与血管病理生理学有关。

Steinkamp等人使用MSOT和与抗VEGF-A偶联的CW800来评估人类颈动脉病变的斑块易损性。他们证明了在体分子评估的安全性和可行性，尽管所使用的剂量未显示出足够的靶点特异性对比。

5.2 纳米颗粒

纳米颗粒（NPs）是工程化的颗粒，通常尺寸为1至100 nm，由于其强光学吸收和有效的光声转换效率而作为造影剂。NPs可以在生物系统中循环并在靶点积累，从而提高成像的灵敏度和特异性。它们由多种材料组成，包括金属基NPs、碳基NPs和有机基NPs。虽然对其物理、修饰和众多变体的详细讨论超出了本综述的范围，但我们将重点介绍与心血管研究最相关的例子。

在金属基NPs中，金NPs因其相对惰性、稳定性、生物相容性和靶向能力而广受认可。金NPs的不同几何形状和PA特性在其他地方有详细综述。已经开发了靶向VCAM-1（早期内皮细胞活化的已知标志物）的金纳米壳。离体和体内实验表明，靶向纳米壳在心脏和主动脉的动脉粥样硬化斑块中积累，从而能够对易损斑块进行成像。

另一类纳米颗粒是碳纳米颗粒（CNPs），它允许共价和非共价修饰。染料、药物或生物分子可以偶联到CNPs上，从而可以添加靶向和信号分子。CNPs体内使用的生物相容性研究仍在进行中。这些研究具有挑战性，因为CNPs在尺寸、形状、表面化学和功能化方面可能存在很大差异，所有这些都会影响它们与生物系统的相互作用。特别令人感兴趣的是Gifani等人描述的碳纳米管在心血管疾病中的应用。他们证明碳纳米管被炎症单核细胞和泡沫状巨噬细胞选择性摄取，从而实现了小鼠动脉粥样硬化斑块的炎症特异性成像。

有机基纳米颗粒也是一个重要的类别，具有很高的基础材料多样性。这些有机NPs可以直接作为信号化合物，增强其他信号化合物，或封装其他化合物以提高生物相容性。最常用的是聚吡咯NPs和卟啉NPs，这些在其他地方有详细综述。有机基NPs一个令人兴奋的应用是靶向动脉粥样硬化中泡沫细胞的脂质NPs，创建“特洛伊泡沫细胞”。为此，通过用特殊设计的脂质体诱导免疫细胞中的脂滴来靶向斑块位置的脂质丰富细胞。脂质体携带一种产生强荧光和PA信号的脂质基探针，允许对斑块区域进行详细成像。

具有PA特性的NPs领域正在迅速发展，并提供了多种可能性。然而，该领域内部仍然缺乏标准化，特别是在生物相容性和相关测试方面。应大力投入完善生物相容性评估，以推进临床应用。

5.3 可激活的光声试剂

可激活的PA试剂根据其环境线索产生PA信号。它们的组成和检测的刺激物存在相当大的多样性（表1）。一类值得注意的可激活PA探针是那些对活性氧（ROS）产生反应的探针。ROS在高炎症组织中产生，可用作动脉粥样硬化斑块不稳定的标志物。例如，Weber等人展示了一种修饰的七甲川染料，当遇到过氧化氢时，其吸收光谱发生红移，从而可以可视化这种ROS的病理生理浓度。此外，金基纳米颗粒已被用于检测ROS。其他可激活的PA试剂在遇到MMPs时会发生变化，或对pH值产生响应。与NPs类似，可激活的PA试剂代表了一类高度多样化的造影剂。然而，该领域目前缺乏标准化和足够的比较数据，使得评估其转化潜力变得困难。

5.4 基因编码标签

内源性和外源性PA试剂之间的一种中间形式涉及基因编码标签。这些基因编码标签利用报告基因，在目的基因的启动子控制下产生PA造影剂。基因编码的绿色荧光蛋白（GFPs）是这一原理的著名例子。GFP不能用于PAI，因为其波长不合适且量子产率低。对GFP样分子的修饰产生了在NIR范围内吸收波长且更适合PA的蛋白质。另一种方法利用黑色素的固有PA特性。Paproski等人展示了使用四环素诱导的黑色素表达系统来检测表达酪氨酸酶的肿瘤。这种方法能够清晰地区分酪氨酸酶阳性和阴性肿瘤。在动脉粥样硬化的背景下，基因编码标签尚未应用，但由于这些标签的高特异性，它们在转化和发现驱动的研究中具有前景。

5.5 微泡

微泡是传统上用于超声成像的造影剂。微泡由一个气体核心和一层蛋白质、脂质或聚合物外壳组成。气体核心使微泡具有高回声性，这非常适合超声成像。由于大多数PAI与超声结合使用，一个合乎逻辑的进展是将微泡也用于PAI。纳米颗粒或PA染料可以与微泡结合以协同工作。例如，Awen等人展示了靶向纤维蛋白的ICG微泡，用于检测与动脉粥样硬化病变相关的微血栓。虽然他们的研究采用了光学荧光成像，但将这种方法转化为PAI的潜力是巨大的。PA微泡对临床转化特别有吸引力，因为它们建立在已批准用于诊断性超声的微泡配方之上。此外，ICG是FDA批准的，进一步支持了转化的可行性。然而，PA组分的添加会影响微泡的稳定性、循环时间和生物分布，这些参数在开发过程中需要仔细优化。

6 结论

光声成像（PAI）是一种新兴的成像模式，在临床前转化研究和未来的临床成像中具有巨大潜力。该成像模式与其他模式相比，提供了卓越的深度和分辨率。持续的技术进步将进一步增强这些特性，特别是在临床应用方面。对内源性成分（尤其是血红蛋白、脂质和胶原）的PAI已证明其在评估心血管病理学方面的有效性。此外，外源性造影剂（如染料和纳米颗粒）允许对非内源性成分进行成像。这些能力共同使PAI成为推进心血管疾病研究并为其临床转化铺平道路的多功能强大工具。