从模拟到免疫：利用CM18-TAT11细胞穿膜肽高效递送HIV-1 Nefmut-Tat DNA疫苗构建体的研究

《International Journal of Pharmaceutics》：From simulation to immunization: efficient non-viral delivery of HIV-1 Nefmut-Tat DNA construct using CM18-TAT11 cell penetrating peptide

本研究针对HIV DNA疫苗免疫原性低的难题，探索了CM18-TAT11细胞穿膜肽(CPP)作为非病毒递送系统的潜力。通过生物信息学模拟、分子动力学(MD)分析和体外/体内实验，证实该肽能高效缩合pDNA形成纳米颗粒，在N/P比为2:1时实现高效转染并激发强烈的Th1和CTL免疫应答，为HIV治疗性DNA疫苗开发提供了新策略。

　　

在人类与艾滋病病毒(HIV)长达四十多年的斗争中，尽管抗逆转录病毒疗法(ART)取得了显著进展，但它仍无法根除患者体内的病毒储存库。这意味着感染者需要终身服药，并面临病毒潜在复发的风险。因此，科学界将目光投向了治疗性疫苗，希望它能调动人体自身的免疫系统来清除病毒，实现功能性治愈。其中，DNA疫苗因其安全性高、易于生产、能同时激发体液免疫和细胞免疫等优势而备受关注。然而，理想的丰满与现实骨感之间存在着巨大差距：裸露的DNA疫苗在体内难以有效地进入细胞，更不用说穿越层层屏障到达细胞核进行表达，这导致其免疫原性往往不尽如人意。

为了解决DNA疫苗递送效率低这一核心瓶颈，研究人员一直在寻找安全高效的“运输工具”。病毒载体虽然转染效率高，但存在免疫原性强、制备复杂等潜在风险。于是，非病毒载体，特别是细胞穿膜肽(CPP, Cell-Penetrating Peptide)成为了研究热点。这些短肽能像“特洛伊木马”一样，携带各种生物大分子（包括DNA）进入细胞。但问题又来了，很多CPP，比如著名的TAT11，虽然能进入细胞，却大部分被困在名为“内体”的细胞器里，无法将“货物”释放到细胞质中，可谓“功亏一篑”。

那么，有没有办法让CPP既能顺利进入细胞，又能成功逃离内体呢？这就是本篇发表在《International Journal of Pharmaceutics》上的研究要回答的关键问题。来自德黑兰医科大学的研究团队Mostafa Gheydi、Azam Bolhassani等人，将目光投向了一种名为CM18-TAT11的嵌合肽。它巧妙地将TAT11的强大细胞穿透能力与CM18（源自蜂毒肽和天蚕素A的杂合序列）的内体逃逸功能结合在一起。此前有研究表明，CM18-TAT11能显著提高 cargo（货物）的胞内摄取和胞质释放。本研究旨在系统评估CM18-TAT11用于递送HIV-1 Nef^mut-Tat融合DNA疫苗构建体的可行性、效率及免疫效果，并结合生物信息学模拟深入探究其作用机制。

为了全面评估CM18-TAT11，研究人员运用了多种关键技术方法。他们首先通过生物信息学工具（如ProtScale、IUPred3、C2pred、MLCPP 2.0等）预测了CM18-TAT11的理化性质、细胞穿透概率、毒性、免疫原性等。接着，利用分子动力学(MD, Molecular Dynamics)模拟揭示了该肽与DNA的相互作用动力学和结合模式。在实验部分，他们通过凝胶阻滞实验、粒度及Zeta电位测量筛选了pDNA/CM18-TAT11复合物的最佳氮磷(N/P)比。使用表达绿色荧光蛋白(GFP)的报告基因质粒，通过流式细胞术和荧光显微镜评估了该复合物在HEK-293T细胞中的转染效率和细胞毒性。最后，在小鼠体内接种了最佳N/P比下的pcDNA-Nef^mut-Tat/CM18-TAT11纳米颗粒，并通过检测抗体水平、细胞因子分泌和细胞毒性T淋巴细胞(CTL, Cytotoxic T Lymphocyte)活性来评价其诱导的抗原特异性免疫应答。

physicochemical characteristics of peptide cm18-tat11

研究人员首先对CM18-TAT11肽本身进行了详细的理化性质分析。预测结果显示，该肽的大部分氨基酸残基具有亲水性，平均柔性从第8位残基的0.42逐渐增加到第24位残基的0.51。其内在无序倾向分析表明，该肽序列可能呈现一定的无序结构特征，这与其作为一种柔性连接肽的功能相吻合。这些基本的理化参数为理解其与DNA的相互作用奠定了基础。

discussion

讨论部分对研究结果进行了深入分析。作者指出，将抗原与CPP共同递送是克服DNA疫苗递送障碍、改善抗原呈递细胞(APC, Antigen-Presenting Cell)呈递的有效策略。本研究通过多学科方法证实了CM18-TAT11作为一种高效、低毒基因递送载体的潜力。分子动力学模拟揭示的两种结合模式，可能对应于肽与DNA相互作用的不同阶段或不同位点，这对于理解其浓缩DNA的机制至关重要。体外实验确定的N/P比为2:1是最佳复合条件，在此条件下形成的纳米颗粒大小均一、稳定性好，且能高效地将质粒递送到细胞内并表达。最重要的是，体内免疫实验证明，该递送系统能够引导免疫反应向Th1型极化，并有效激发CTL反应，这对于清除HIV感染的细胞至关重要。

conclusion

总结而言，本研究成功验证了CM18-TAT11细胞穿膜肽在递送HIV-1 Nef^mut-Tat DNA疫苗中的应用。研究不仅发现了肽与DNA之间存在浓度依赖性的相互作用模式，而且确定了形成稳定复合物的最佳N/P比（2:1），该复合物能显著提高细胞摄取和基因表达效率。更重要的是，基于该肽的疫苗纳米颗粒能够诱导强烈的Th1型免疫应答和CTL活性。这些发现为开发新型HIV治疗性DNA疫苗提供了一个强大且安全的非病毒递送平台，具有重要的转化医学价值。

credit authorship contribution statement

根据作者贡献声明，本研究由Mostafa Gheydi主要负责实验操作、数据分析及论文初稿撰写；Azam Bolhassani作为项目负责人，提供了总体构思、研究指导和支持；Babak Negahdari和Parisa Moradi Pordanjani等人也参与了研究讨论和论文修订工作。所有作者均声明无利益冲突。

这项研究的意义在于，它不仅仅是对一种新型递送材料的简单测试，而是通过从计算机模拟到体外、体内实验的完整证据链，系统论证了CM18-TAT11肽的应用前景。它为解决DNA疫苗领域的核心难题——递送效率低、免疫原性弱——提供了一个切实可行的解决方案，为最终攻克HIV及其他难治性疾病的疫苗研发带来了新的希望。