VCAM-1功能化的氧化铁纳米簇，用于基于磁共振成像（MRI）的动脉粥样硬化靶向诊断

《MedComm – Biomaterials and Applications》：VCAM-1-Functionalized Iron Oxide Nanoclusters for Targeted MRI-Based Diagnosis of Atherosclerosis

本研究通过高温度聚醇法制备了铁氧化物纳米簇（NCs），并利用EDC/NHS化学修饰其表面，成功偶联血管细胞粘附分子1（VCAM-1）抗体。实验证实，修饰后的NCs在动态剪切应力条件下仍能稳定靶向表达VCAM-1的间充质干细胞（MSCs），并保持优异的MRI检测性能。该纳米探针为早期动脉粥样硬化非侵入性诊断提供了新工具，同时为后续治疗联合应用奠定了基础。

　　本文探讨了一种新型铁氧化物纳米簇（NCs）的开发与表征，这些纳米簇被功能性修饰以靶向血管细胞粘附分子1（VCAM-1），用于早期动脉粥样硬化病变的磁共振成像（MRI）。研究通过高温度多醇法合成纳米簇，并利用EDC/NHS化学方法将其与VCAM-1抗体偶联，从而赋予其靶向能力。研究结果表明，这些功能化纳米簇在体外和模拟生理剪切应力条件下表现出良好的生物相容性、靶向特异性以及在动态环境下的稳定性。尽管该研究尚未进行体内成像实验，但其结果为未来的转化研究提供了坚实的基础。

动脉粥样硬化是心血管疾病（CVD）的主要诱因，通常表现为冠状动脉疾病、中风和外周动脉疾病。该疾病具有渐进性特征，涉及脂质沉积、免疫细胞浸润、内皮功能障碍以及血管壁斑块形成。这些变化可能导致血管狭窄或斑块破裂，进而引发急性临床事件。尽管高血压、糖尿病和高脂血症等经典风险因素已被广泛认可，但心血管疾病仍可能在低风险人群中发展。因此，早期检测亚临床病变是预防心脏病学的关键。

目前，冠状动脉造影仍是诊断的金标准，但其具有侵入性，不适合早期筛查。此外，许多患者，特别是女性，即使在没有血流限制性狭窄的情况下也可能表现出缺血症状，这突显了需要评估分子和结构病变特征，而不仅仅是血流动力学因素。临床医生正在逐渐关注非阻塞性冠状动脉疾病，将注意力从评估冠状动脉血流转向量化病变的解剖和分子负担。改进的造影技术与先进的成像方式，以及结合基因标志物、微量元素或机器学习的风险预测方法，正在被探索，以实现早期检测和预后评估。

磁共振成像（MRI）因其高空间分辨率、优异的组织对比度以及无电离辐射等优点，已成为血管成像的重要工具。造影剂通过改变质子的弛豫特性来提高诊断的敏感性：（i）顺磁性钆螯合物作为T1造影剂，产生明亮信号；（ii）超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）缩短T2弛豫时间，产生暗信号。在这些造影剂中，SPIONs因其生物相容性、生物降解性和表面化学的多样性而特别引人注目。例如，Endorem?和Resovist?等SPION基造影剂曾被临床批准用于肝脏和血管成像，这为设计下一代基于氧化铁的分子成像探针奠定了基础。

靶向成像通过将探针定向到分子生物标志物进一步提高特异性。VCAM-1在健康血管中表达微弱，但在动脉粥样硬化早期激活内皮时显著上调。其选择性表达和在白细胞募集中的作用使其成为血管炎症分子成像的有效靶点。然而，纳米颗粒系统在MRI中的应用面临一些挑战，包括胶体稳定性、免疫原性和信号增强不足。为了解决这些问题，我们之前开发了一种通过多醇介导的高温方法合成的磁赤铁矿纳米簇（NCs），显示出优于Endorem?的T2弛豫性、体内分布和稳定性。这些纳米簇提供了一个灵活的平台，可用于功能化。

在本研究中，我们通过EDC/NHS化学方法将VCAM-1抗体偶联到铁氧化物纳米簇上。我们系统地对其物理化学特性、细胞相容性和靶向特异性进行了表征，特别是在VCAM-1高表达的间充质干细胞（MSCs）中。此外，我们还通过一个模拟动态流动环境的轨道摇床模型研究了其在生理剪切应力下的性能。尽管在1.25 mM铁浓度下，SPIONs如Feridex、Resovist和Sinerem表现出强烈的T2缩短效应，但与这些造影剂类似，VCAM-1-NCs也保留了相当的MRI性能。同时，通过共聚焦和电子显微镜观察了其细胞内化和内体-溶酶体途径的运输过程。虽然体内成像尚未在本研究中进行，但我们的结果提供了概念验证的证据，表明VCAM-1-NCs是早期动脉粥样硬化靶向成像的有希望候选者，并为未来的转化和治疗研究奠定了基础。

在研究中，我们对合成的铁氧化物纳米簇进行了系统表征。通过动态光散射（DLS）、透射电子显微镜（TEM）和Zeta电位分析，我们在功能化前后评估了其物理化学特性。DLS测量显示，未功能化的纳米簇的水动力直径约为40 nm，功能化后增加至约50 nm，抗体偶联后进一步增至约110 nm。这种尺寸的增加与多个VCAM-1抗体在纳米簇表面的附着有关。考虑到IgG抗体的最大尺寸约为14 nm，以及Alexa Fluor 488荧光染料的尺寸小于1 nm，所观察到的水动力体积增长很可能反映了纳米簇表面形成了一层异质的抗体包覆。最终的尺寸约为110 nm，与已批准的Feridex?（120–180 nm）处于临床相关范围内，而未功能化和EDC/NHS功能化的纳米簇则与Resovist?（45–60 nm）的尺寸接近。

Zeta电位测量进一步支持了胶体稳定性。未功能化的纳米簇的表面电荷约为-20 mV，功能化后变为-28 mV，抗体偶联后达到-63 mV。表面电荷的逐渐增加与聚丙烯酸（PAA）上的羧基以及抗体包覆的额外贡献有关。电位值超过±30 mV的颗粒被认为是抗聚集的，因为它们具有强的静电排斥力。因此，我们的结果确认了VCAM-1-NCs在生理pH下形成稳定的分散体系。文献报告也支持抗体包覆的纳米簇在生物流体中表现出更强的抗聚集能力以及更长的体内循环时间。

总的来说，DLS、TEM和Zeta电位测量的综合证据表明，铁氧化物纳米簇的抗体功能化使其水动力尺寸进入临床相关范围，同时保持形态和胶体稳定性。这些物理化学特性符合靶向MRI探针的要求，并为后续的生物评估奠定了基础。

为了验证功能化纳米簇的生物相容性，我们进行了细胞毒性研究。在之前的实验中，我们已经证明了纳米簇在体外的生物相容性和体内分布。在此研究中，我们使用了Live/Dead实验，以确认功能化纳米簇对MSCs的生物相容性。结果显示，所有样本之间没有显著的统计学差异，表明MSCs在暴露于未功能化或EDC/NHS功能化的纳米簇后仍然保持高存活率。这些结果与我们之前发表的研究一致，并且与文献中其他铁氧化物纳米颗粒的高生物相容性相符。

功能化纳米簇的靶向能力在体外实验中得到了验证。通过将MSCs暴露于RAW264.7细胞条件培养基诱导VCAM-1的高表达，我们测试了抗体偶联纳米簇的靶向功能。共聚焦显微镜（图3A）确认了VCAM-1在炎症条件下的膜表达，而扫描电子显微镜（图3B）直接可视化了纳米簇与细胞表面的结合。正常情况下，MSCs不表达VCAM-1，用作阴性对照，而暴露于炎症细胞因子后，VCAM-1的膜定位变得明显。自由抗体和aVCAM-1-NCs的检测模式相似，表明抗体偶联保留了结合活性，即使EDC/NHS化学方法可能导致随机取向。

功能化纳米簇的细胞内化和亚细胞定位也得到了研究。通过将MSCs暴露于炎症条件，并与aVCAM-1-NCs孵育，我们使用共聚焦显微镜观察了纳米簇的内化过程。在4°C下进行的孵育显示纳米簇主要位于细胞表面，没有检测到细胞内荧光，这意味着纳米簇的被动跨膜运输有限。而在37°C下进行的孵育显示，纳米簇在5小时内逐步内化。在早期时间点，主要检测到表面的aVCAM-1-NCs，随着时间的推移，细胞内的绿色荧光强度逐渐增加，首先出现在内体中，随后出现在核周区域，其中含有溶酶体。这种绿色荧光的增强表明纳米簇在细胞内的积累。纳米簇在靶向细胞内至少5小时的积累确保了更高的位点特异性MRI信号，并有助于使用较低剂量进行动脉粥样硬化诊断。

从纳米簇的内部荧光信号来看，其与AO染色的模式一致，表明内化的纳米簇通过内体-溶酶体途径运输。这一特性与带负电荷的纳米簇预期的运输机制相符。纳米簇在内体和溶酶体中的定位提示了其在细胞内的命运。我们预计，在内体的低pH环境下，EDC/NHS交联将被逆转，生物偶联的抗体将从纳米簇表面释放，留下裸露的纳米簇。

为了研究纳米簇在体外模拟的轨道剪切应力（OSS）条件下的行为，我们使用了一个轨道摇床系统，以诱导培养板中的流动条件。该模型可以生成从几乎单向（对内皮细胞有保护作用）到高度扰动和振荡（与动脉粥样硬化和内膜增生相关）的剪切应力。轨道摇床平台的运动在培养板底部产生一个旋转的流动波，从而对细胞施加剪切应力。在图5a,b中，我们展示了培养板底部的瞬时WSS（壁剪切应力）大小及其在不同半径处的角分布。靠近板边缘的高WSS区域随着轨道摇床平台的角速度旋转，形成一个路径，这表明细胞经历了时间变化的几乎单向剪切应力。在培养板中心区域，细胞暴露于多方向剪切应力，其幅度低于边缘区域，且不随平台运动变化。板边缘的流动条件被认为是动脉粥样硬化保护性的，而中心区域的流动条件则被认为是动脉粥样硬化诱发性的。

MSCs在静态或OSS条件下与aVCAM-1-NCs孵育后，样品被固定并使用共聚焦显微镜和SEM进行观察。图6a显示了代表性共聚焦和SEM图像，表明aVCAM-1-NCs能够检测并结合细胞表面的VCAM蛋白。即使在剪切应力条件下，纳米簇仍表现出结合能力，并牢固附着在细胞上，强调了其在细胞相互作用中的稳定性和持久性。我们的观察还表明，VCAM-1的表达在测试的培养条件下保持一致，未受剪切应力影响。这一观察通过图6b中的条形图得到验证，该图显示了从共聚焦图像中获得的每个样本的平均荧光强度（MFI）。

这些结果表明，无论是静态还是动态条件，以及是在培养板的中心还是边缘区域，剪切应力和位置都不会显著改变VCAM-1表达或aVCAM-1-NCs附着的行为。所选的流动模型复制了两个临床上相关的特点：它产生脉动流，类似于较大动脉中的自然血流，并允许细胞在相同的设置中暴露于两种不同的剪切应力环境。这种方法模拟了体内同一血管中可能遇到的生理和非生理剪切应力，如分叉、狭窄、扩张或动脉粥样硬化斑块。纳米簇在生理和病理条件下的持久附着，结合其对VCAM-1的特异性，突显了其在靶向细胞研究、诊断或治疗应用中的潜力。

MRI假人实验表明，VCAM-1-NCs保留了有效的T2*加权对比能力，尽管在抗体偶联后弛豫时间有所延长。我们使用ROI分析来提取每种样本在不同回波时间（TE）下的信号强度，从而得出T2*值。图7展示了在1.25 mM铁浓度下，未功能化纳米簇、EDC/NHS功能化纳米簇和aVCAM-1-NCs的T2*信号衰减与回波时间的关系。这些结果支持了VCAM-1-NCs在体内应用中的可行性。

尽管在本研究中没有进行体内MRI实验，但我们的数据为未来研究奠定了坚实的基础。此外，该纳米簇的模块化设计和高效的细胞摄取能力也暗示了其在治疗应用中的潜在价值。总体而言，这些纳米簇代表了一个稳健、可调节的系统，具有在心血管分子成像应用中进行转化的强大力量。

在材料和方法部分，我们详细描述了合成γ-Fe?O?纳米簇的过程。铁氧化物纳米簇的合成采用了高温度多醇法，在氩气气氛中进行，并使用聚丙烯酸（PAA）作为稳定剂。反应在高温下进行，以促进γ-Fe?O?纳米晶体的可控聚集。所得沉淀物通过乙醇和水多次洗涤，磁分离后重新分散在水溶液中。

为了实现抗体偶联，我们使用EDC/NHS作为交联剂。具体而言，将EDC（200 μL，50 mg/mL在PBS中，pH 7.4）和NHS（200 μL，100 mg/mL在PBS中）添加到调整pH至约7.4的纳米簇悬浮液中。混合物在室温下孵育15分钟，以促进共价偶联。多余的试剂通过多次乙醇洗涤和磁分离去除，然后将纯化的纳米簇重新分散在水中。

为了进行抗体偶联，我们使用了50 μL的纯化EDC/NHS偶联的纳米簇，其表面具有活化的-COOH基团。这些纳米簇在1 mL的10× PBS中与5 μL的Alexa Fluor? 488抗小鼠CD106抗体溶液（浓度为0.5 μg/μL）反应30分钟，温度为4°C，并在黑暗中进行。反应完成后，通过磁分离从过量的CD106抗体中分离出CD106-EDC/NHS偶联的γ-Fe?O?纳米簇，并将其重新分散在1 mL的1× PBS中，以供后续实验使用。

为了确定纳米簇的尺寸和Zeta电位，我们使用了DLS技术。分析通过Malvern Instruments Zeta-Sizer进行，该仪器使用4.0 mW的He-Ne激光器（波长为633 nm）和雪崩光电二极管检测器。三种样本类型被评估：裸纳米簇（a）、EDC/NHS功能化纳米簇（b）和EDC/NHS-aVCAM-1纳米簇（c）。所有样本在1× PBS中稀释，浓度为100 μgr/mL γ-Fe?O?。

透射电子显微镜（TEM）用于进一步确认纳米簇的形态和尺寸。在LaB? JEOL 2100电子显微镜上以200 kV的加速电压拍摄明亮场TEM图像。为了进行TEM分析，将稀释的纳米簇溶液滴在碳涂覆的铜TEM网格上。所有图像由Gatan ORIUS? SC 1000 CCD相机记录。

间充质干细胞（MSCs）和RAW264.7巨噬细胞用于实验。MSCs在低葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco）中培养，补充10%（v/v）胎牛血清（FBS；Gibco）和1%（v/v）青霉素/链霉素（P/S；Gibco），在37°C、5% CO?培养箱中培养。细胞在第10代以下进行培养，每3–4天更换培养基。RAW264.7巨噬细胞在DMEM中培养，补充10% FBS和1% P/S，直到达到汇合状态。

为了诱导MSCs的VCAM-1表达，我们使用RAW264.7细胞条件培养基（与培养基按1:1混合）处理MSCs 24小时。在纳米簇摄取实验中，MSCs在37°C下孵育1小时，随后使用共聚焦显微镜在10分钟、60分钟、3小时和5小时的时间点进行分析。

为了模拟血管剪切应力，我们使用轨道摇床系统在静态或OSS条件下孵育VCAM-1高表达的MSCs。该系统在37°C下以90或180 rpm的速度运行，持续1小时。孵育后，细胞被固定并使用共聚焦和扫描电子显微镜进行分析。轨道系统能够再现外围的高单向剪切应力（保护性）和中心的低多向剪切应力（诱发性），从而模拟相关的血管环境。

在数值模拟方面，我们使用Fluent v12（ANSYS Inc.）对轨道摇床进行了模拟。计算域是一个直径为16 mm、高度为9.75 mm的圆柱体，填充水至3 mm深度，使用约230,000个六面体单元进行离散化。边界条件包括底部和侧壁的无滑移条件，以及自由表面的压强出口。水和空气被建模为不可压缩的牛顿流体，密度分别为1003 kg/m3和1.225 kg/m3，粘度分别为0.78×10?3 Pa·s和1.7894×10?? Pa·s。轨道运动通过时间变化的重力场建模。

MRI检测和分析使用1特斯拉的Philips临床扫描仪进行，采用多回波快速场回波GRE序列（12回波，TE=1.9–13.9 ms，TR=357 ms，切片厚度=2 mm，视野=200×200 mm2）。未功能化的纳米簇、EDC/NHS功能化的纳米簇和aVCAM-1-NCs均分散在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，PBS单独作为对照。在所有假人中，一致地绘制感兴趣区域（ROIs）以提取回波时间下的信号强度。

本研究测量了T2*弛豫时间，这是考虑磁场不均匀性的T2横向磁化弛豫时间。根据已建立的MRI理论，内在T2与有效T2*弛豫时间之间的关系为：

T2* = T2 + ΔB0

其中，ΔB0代表局部磁场不均匀性。MR信号衰减通过时间依赖性表达进行分析：

M(t) = M0 * exp(-t / T2*)

其中，M(t)是时间t的横向磁化，M0是初始横向磁化，T2*是有效横向弛豫时间。进一步的实验细节（假人制备、ROI放置策略和成像软件）在支持材料§S1.3中描述。

所有实验至少重复三次。对于每个实验，使用GraphPad Prism Version 9.0.0（GraphPad Software）进行单因素方差分析（ANOVA）和Tukey HSD事后检验。p值小于0.05的被认为是统计学显著的，并标记为*p* < 0.05，**p* < 0.01或***p* < 0.001。

作者贡献部分，Lina Papadimitriou负责撰写初稿、方法、数据整理和可视化；Maria Graigkioti负责撰写初稿、方法、可视化和数据整理；Eirini Koutsouroubi和Konstantinos Pagonidis负责方法和数据整理；Yannis Papaharilaou负责撰写审查与编辑、概念化、资金获取、可视化和研究；Anthi Ranella负责撰写审查与编辑、方法、概念化、资源、监督、资金获取和研究；Alexandros Lappas负责概念化、方法、撰写审查与编辑、资金获取、监督、资源和研究。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

致谢部分，作者感谢Lampros Papoutsakis在TEM实验中的宝贵帮助。图形摘要由BioRender.com创建。本研究得到了Theodore Papazoglou FORTH Synergy Grant 2021（GA 2021）的支持。

利益冲突声明中，作者声明没有利益冲突。

细胞系认证和质量控制部分，作者从供应商（Cyagen，ATCC）获得了认证证书（STR/COA）。所有培养物在使用前均被确认为无支原体污染。