靶向正黄病毒NS2B-NS3蛋白酶的新型脂肽类广谱抗病毒先导化合物的发现与优化

《Journal of Medicinal Chemistry》：Beyond the “2 + 2 Pharmacophore” Electronic and Hydrophobic Effects Control the Activity of Cationic Amphiphilic Antimicrobial 2,5-Diketopiperazines

本研究针对正黄病毒属感染缺乏特效疗法的难题，聚焦其关键靶点NS2B-NS3蛋白酶，开展基于脂肽支架的药物化学优化。研究人员设计合成了73个化合物，系统研究了其构效关系，最终发现化合物73和79能选择性抑制登革病毒(DENV2)、西尼罗病毒(WNV)和寨卡病毒(ZIKV)的NS2B-NS3蛋白酶，并在细胞感染模型中显示出低微摩尔级的抗病毒活性，且无明显细胞毒性。其中化合物73在小鼠体内表现出良好的药代动力学特性和耐受性。该研究为开发广谱抗正黄病毒药物提供了有前景的先导化合物。

　　

在全球热带和亚热带地区，由蚊子传播的正黄病毒属病毒感染，如登革病毒(DENV)、寨卡病毒(ZIKV)和西尼罗病毒(WNV)，对公共卫生构成日益严重的威胁。尽管这些病毒感染很少致命，但它们可能导致严重的病理后果，例如登革热引起的登革出血热和休克综合征，寨卡病毒感染导致的胎儿小头畸形和格林-巴利综合征，以及西尼罗病毒感染引起的脊髓灰质炎样症状。迄今为止，除了支持性护理外，尚无批准的特异性治疗方法来应对这些疾病。虽然针对寨卡病毒、西尼罗病毒和其他正黄病毒的疫苗接种临床试验最近已经启动，但登革热疫苗Dengvaxia的疗效存在争议，且其风险对于此类预防性疗法而言过高，这再次凸显了全球对特异性抗病毒治疗的迫切需求。

正黄病毒的非结构蛋白NS3与其辅因子NS2B形成的异源二聚体蛋白酶（NS2B-NS3）在病毒多蛋白的加工成熟过程中起着至关重要的作用，因此已成为抗正黄病毒药物开发的一个有吸引力的靶点。利用病毒蛋白酶天然底物的结构作为支架来开发抗病毒药物是一种有效的策略，此前已在针对HIV、HCV和SARS-CoV--2的市场化抗病毒药物开发中成功应用。然而，开发NS2B-NS3竞争性抑制剂面临的一个挑战是，将生化 assay 中获得的病毒蛋白酶抑制效力转化为有效的细胞抗病毒活性存在困难，这主要是由于具有多个电荷的高分子量肽类的细胞渗透性较低。

先前的研究报道了多碱性双亲化合物Geminoids（如化合物4-6）能够抑制DENV2 NS2B-NS3，并在DENV2感染的细胞中显示出微摩尔级的抗病毒活性，且细胞毒性较低。然而，这些Geminoids分子量高（超过800 Da），具有两个对称的线性烷基末端和多个可质子化的氮原子，导致其形成两亲性分子，临界胶束浓度(CMC)处于亚毫摩尔级。胶束聚集可能干扰抑制效力和抗病毒活性的测定，并可能诱导毒性，因此其类药性较差。

为了解决这些问题，来自荷兰拉德堡德大学分子与材料研究所的Lorenzo Cavina等研究人员在《Journal of Medicinal Chemistry》上发表了他们的研究成果。他们以Geminoid支架为起点，通过系统的结构-活性关系(SAR)研究，旨在发现和优化一类更类药、有效的抗正黄病毒先导化合物。

为了开展研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：采用固相肽合成(SPPS)与液相肽合成相结合的策略高效构建脂肽库；通过基于荧光共振能量转移(FRET)的生化 assay 测定化合物对DENV2、WNV和ZIKV NS2B-NS3蛋白酶的半数抑制浓度(IC₅₀)；利用细胞病变效应(CPE)保护实验、免疫过氧化物酶染色法和免疫荧光焦点形成实验等多种细胞感染模型评估化合物的抗病毒活性(EC₅₀)和细胞毒性(CC₅₀)；通过酶动力学实验分析先导化合物的抑制机制；并在雌性C57BL/6小鼠中进行体内药代动力学(PK)研究，评估化合物经静脉(IV)、腹腔(IP)和皮下(SC)给药后的稳定性和耐受性。

库I：N端和C端取代基的探索

研究人员首先合成了库I的化合物，旨在研究Geminoids 4-6末端的棕榈酰基和正十六烷基对DENV2 NS2B-NS3抑制活性的影响，探索其末端是否需要一个或两个烷基取代基，或者是否耐受棕榈酰基和十六烷基以外的部分。结果表明，只有在C端酰胺上带有十六烷基（化合物34-36）或在N端带有棕榈酰基（化合物37-39）的化合物才能有效抑制DENV2 NS2B-NS3，IC₅₀在低微摩尔范围（1.5-3.9 μM）。这表明棕榈酰基或十六烷基部分对于抑制是必需的。在细胞感染实验中，除了化合物37，其他化合物均能在低微摩尔范围内（EC₅₀ 2.0-9.5 μM）降低DENV2感染。基于合成便捷性和潜在的代谢稳定性考虑，研究人员选择进一步研究N端棕榈酰化、C端为伯酰胺的脂肽支架（palmitoyl-XXXX-NH₂）。

库II：序列筛选

在库II中，研究人员对脂肽支架的肽序列进行了广泛优化，包括缩短肽链长度、引入构象限制性氨基酸（如脯氨酸Pro或其类似物哌啶酸Pip）、将P1位的碱性氨基酸替换为芳香族氨基酸、以及在不同位置引入D-型氨基酸等。他们合成了大量化合物（40-79），并系统评估了其生化抑制活性和细胞抗病毒活性。研究发现，完全不含可质子化氮原子的化合物（如54和59）在50 μM浓度下对DENV2 NS2B-NS3没有显著抑制，而携带至少一个可质子化氮（Arg或Lys）的化合物则能有效抑制蛋白酶，IC₅₀在低微摩尔范围。值得注意的是，病毒蛋白酶的抑制效力与细胞感染模型中的病毒载量减少并不直接相关。一些在生化 assay 中强效的抑制剂在细胞模型中显示出高细胞毒性或显著更高的EC₅₀。在KAAK序列的P3位引入Pro（化合物47）或对P2位进行差向异构化（化合物73）改善了细胞的耐受性谱。最终，化合物73（Palmitoyl-Lys-Ala-d-Ala-Lys-NH₂）因其在DENV2感染细胞中展现出最有前景的抗病毒活性和耐受性谱而脱颖而出。

广谱抗正黄病毒特性及宿主蛋白酶选择性

研究人员进一步选取化合物73、78和79，测试了其对WNV和ZIKV NS2B-NS3的抑制活性。结果显示，这三种化合物均能在低微摩尔范围内抑制WNV和ZIKV的病毒蛋白酶，特别是对ZIKV病毒蛋白酶的抑制与对DENV2的抑制有良好的相关性。化合物73是表中对ZIKV蛋白酶最有效的抑制剂（IC₅₀ = 1.9 μM），而化合物79对WNV蛋白酶最有效（IC₅₀ = 6.7 μM）。此外，这些脂肽化合物在50 μM浓度下对宿主丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶和凝血酶的抑制均不显著，表明该支架对病毒蛋白酶具有选择性。

化合物73的抑制动力学

对化合物73的抑制动力学评估显示，其IC₅₀在不同底物浓度（50-200 μM）下保持稳定（约7 μM），表明其为非竞争性抑制。其抑制常数K_i值与IC₅₀相同。这种非竞争性结合模式提示化合物73可能不是DENV2 NS2B-NS3的 orthosteric （正构）抑制剂，但此前也有研究报道过以非竞争方式抑制蛋白酶的正构抑制剂。需要进一步研究以明确化合物73是否与活性位点相互作用，或是结合在蛋白酶的变构位点。

化合物73的体内药代动力学

在雌性C57BL/6小鼠中进行的体内药代动力学研究表明，化合物73在静脉(IV, 5 mg/kg)、腹腔(IP, 10 mg/kg)和皮下(SC, 10 mg/kg)注射后表现出良好的药代动力学特征和耐受性。静脉给药后，其消除半衰期(t_1/2)约为9.8小时，清除率较低。腹腔和皮下给药的生物利用度分别为57%和63%。值得注意的是，皮下给药在消除半衰期和分布容积方面表现出较大的个体间变异性，这可能与皮下组织成分的差异有关，但也可能带来更高的组织分布和潜在的缓释（储库）效应，这对于主要感染外周组织细胞的正黄病毒而言可能是有利的。根据血浆浓度-时间曲线，在当前剂量下，化合物73在皮下和腹腔给药后能维持血浆浓度高于EC₅₀约6小时，提示将剂量加倍至20 mg/kg并每日两次给药可能是在小鼠中实现持续疗效的必要方案。

本研究成功地对Geminoid支架（化合物4-6）进行了优化，获得了类药性更佳、在体外具有相当或更优的细胞活性和耐受性、且在体内表现出良好稳定性和耐受性的脂肽衍生物。通过系统的SAR研究，确定了N端棕榈酰化的短脂肽（palmitoyl-XXXX-NH₂）作为一个有前景的新型支架。经过多轮体外实验和SAR探索，化合物73和79被鉴定为NS2B-NS3抑制剂，在DENV2、WNV和ZIKV细胞感染模型中均表现出低微摩尔级的广谱抗正黄病毒活性。其中，化合物73展现出更均衡的广谱活性、对宿主蛋白酶的选择性、良好的细胞耐受性以及非竞争性的抑制机制。其在小鼠体内的药代动力学特征表明，通过皮下给药可能获得治疗优势。尽管需要进一步提高效力并探索口服生物利用度以实现向人类的转化，但本研究确定的脂肽支架，特别是化合物73，为开发广谱抗正黄病毒药物提供了极具潜力的先导化合物，值得进行进一步的体内功效评估。