利用细胞内19F NMR探索新型氟化化合物与碳酸酐酶亚型的细胞内结合特性

《Journal of Medicinal Chemistry》：Intracellular Binding of Novel Fluorinated Compounds to Carbonic Anhydrase Isoforms Explored by In-Cell 19F NMR

本研究针对药物开发中候选分子能否有效到达并结合细胞内靶点的关键挑战，利用配体观察的细胞内19F NMR技术，在活体人细胞中表征了新型氟化磺胺衍生物与多种胞质碳酸酐酶(CA)亚型的相互作用。研究人员评估了各配体的靶点结合能力和膜通透性，建立了化合物对各亚型的定性亲和力排序，发现细胞内亲和力排名与体外酶抑制实验结果存在显著差异，凸显了在细胞模型中进行早期筛选的重要性。该研究为开发亚型选择性CA抑制剂提供了有前景的支架，同时展示了细胞内19F NMR在生理相关环境中直接研究配体-靶点相互作用的强大潜力。

　　

在药物研发的漫长征程中，有一个令人困扰的"黑箱"问题：许多在体外实验中表现优异的候选药物，一旦进入真实的细胞环境就会"失灵"。这种现象常常导致药物研发在后期阶段功亏一篑，造成巨大的时间和资源浪费。问题的根源在于，传统的体外实验无法完全模拟细胞内部的复杂环境——药物需要穿越细胞膜这道"安检门"，还要在拥挤的细胞内"精准定位"到目标蛋白，同时避免被其他细胞成分"误抓"。正是为了解决这一关键挑战，来自CERM磁共振中心的研究团队开展了一项创新性研究，他们的成果发表在《Journal of Medicinal Chemistry》上。

研究人员将目光投向了碳酸酐酶(CA)这一重要的药物靶点。碳酸酐酶是人体内关键的锌离子依赖性酶家族，负责催化二氧化碳与水生成碳酸氢根的可逆反应，在pH调节、呼吸作用等生理过程中扮演着重要角色。人类体内存在15种不同的CA亚型，它们在组织分布和亚细胞定位上各具特色，其中胞质亚型如CA1、CA2、CA3、CA7和CA13是重要的药物靶点。然而，由于这些亚型的活性位点高度保守，开发具有亚型选择性的抑制剂一直是个巨大挑战。

为了在活细胞中直接观察药物与靶点的相互作用，研究团队采用了一种巧妙的技术策略——细胞内¹⁹F核磁共振(NMR) spectroscopy。¹⁹F NMR具有独特的优势：自然界中几乎不存在背景氟信号，灵敏度高，且氟原子的化学位移对环境变化极为敏感，就像是一个精密的"分子探针"。研究人员设计合成了7种带有三氟甲基(-CF₃)基团的新型磺胺类化合物，这些氟化"标签"使得他们能够在活细胞中实时"追踪"这些化合物的行踪。

关键技术方法包括：利用人胚肾细胞(HEK293T)瞬时过表达五种人源胞质CA亚型；通过细胞内¹⁹F NMR直接观察配体-靶点相互作用；采用竞争性结合实验进行定性亲和力排序；使用NMR生物反应器实时监测化合物摄取动力学；应用细胞热迁移分析(CETSA)独立验证靶点结合。所有实验均使用人源细胞系进行。

结果与讨论

CA亚型的表达与细胞内行为

研究人员首先在人类细胞中表达了五种胞质CA亚型(CA1、CA2、CA3、CA7和CA13)。表达水平分析显示，CA1、CA2和CA3的细胞内浓度达到130-170 μM，而CA7和CA13的表达水平较低，分别为约50 μM和80 μM。通过¹H-¹⁵N NMR分析发现，CA1、CA2和CA3在细胞内能产生清晰的NMR信号，而CA7和CA13由于与细胞内组分相互作用导致信号展宽而无法检测，这表明靶点观察方法对某些靶点存在局限性。

氟化配体的设计与表征

研究团队设计合成了7种新型氟化苯磺胺类化合物(化合物1-7)，这些化合物以磺胺和SLC-0111为先导结构，通过引入三氟甲基基团使其适用于¹⁹F NMR检测。体外抑制实验显示，所有化合物对CA1、CA2、CA7和CA13均表现出抑制活性，但对CA3无抑制作用，这与CA3活性位点存在苯丙氨酸取代导致空间位阻增加的特性一致。

细胞内结合特性的表征

细胞内¹⁹F NMR实验证实，除CA3外，所有化合物均能与CA1、CA2、CA7和CA13在细胞内形成复合物。值得注意的是，化合物5和7还显示出可能与细胞内其他组分非特异性结合的额外信号，提示这些化合物可能存在脱靶效应。

亲和力排序与细胞通透性

通过竞争性结合实验，研究人员建立了化合物对不同CA亚型的定性亲和力排序。令人惊讶的是，细胞内亲和力排名与体外测定的抑制常数(K_I)不存在相关性，这突显了细胞环境对配体-靶点相互作用的复杂影响。实时摄取动力学实验进一步揭示，化合物6具有显著更快的细胞膜通透性，使其成为未来竞争性筛选研究的理想"探针"配体。

靶点结合的独立验证

CETSA实验证实，化合物4-7能够显著提高内源性CA2的热稳定性，而化合物2虽然通过NMR检测到结合，但对蛋白热稳定性影响较小，这体现了CETSA与NMR技术的互补性。

研究结论与意义

本研究成功利用细胞内¹⁹F NMR技术，在生理相关环境中直接表征了新型氟化抑制剂与胞质CA亚型的相互作用。研究发现，细胞内亲和力排名与体外实验存在显著差异，强调了在细胞模型中进行早期药物筛选的重要性。化合物7显示出最高的亲和力，但伴随潜在的非特异性结合问题；化合物6则因其优异的膜通透性而成为理想的"间谍"配体，可用于未来非氟化候选药物的竞争性筛选。

从方法论角度，这项研究突破了靶点观察方法的局限性，为研究那些因与细胞组分相互作用而难以直接检测的靶点提供了新策略。虽然目前的亲和力排序是定性的，但在更受控的实验条件下，该方法有望实现基于细胞内解离常数(K_d)的定量排序。这些氟化配体不仅是开发亚型选择性CA抑制剂的有前景支架，更是探索细胞内药物-靶点相互作用的强大化学工具。

总体而言，该研究凸显了细胞内¹⁹F NMR在药物开发中的巨大潜力，为在生理相关环境中直接研究配体-靶点相互作用提供了强大而灵活的技术平台，有望在早期药物筛选阶段提供更可靠的决策依据，从而提高药物研发的成功率。