基于酶激活远红外荧光探针的微塑料肝损伤动态成像新方法

《Talanta》：Dynamic in vivo imaging of microplastic-induced hepatic injury via enzyme-activated far-red fluorescent probe

微塑料污染对健康的威胁日益凸显，但缺乏动态可视化工具阐明其肝毒性机制。本研究开发了远红外荧光探针DDAO-CT，通过酶激活机制实现对糜蛋白酶（chymotrypsin）活性的特异性检测。该探针在674 nm处产生14倍荧光增强，成功应用于PS微塑料暴露的肝细胞和小鼠模型，首次实现微塑料诱导肝损伤的动态可视化，为环境污染物毒性评估提供新型化学生物学平台。

　　

当塑料制品在自然环境中逐渐分解为直径小于5毫米的微塑料颗粒，这些看似微小的污染物正通过食物链悄然进入人体。其中，聚苯乙烯（PS）微塑料因其环境持久性和生物累积性，尤其令人担忧。作为人体最重要的代谢解毒器官，肝脏成为微塑料攻击的主要靶标。研究表明，PS微塑料可引发氧化应激、炎症反应甚至铁死亡（ferroptosis），导致肝细胞坏死和纤维化。然而，科学界一直缺乏能够在活体动态监测微塑料累积过程并阐明其肝毒性机制的有效工具。

糜蛋白酶作为一种丝氨酸蛋白酶，在微塑料暴露后被证实具有抑制炎症和氧化应激的保护作用，其活性变化可作为肝损伤补偿反应的重要生物标志物。但现有糜蛋白酶荧光探针存在发射波长短、组织穿透力差、合成复杂等缺陷，严重限制其在活体成像中的应用。针对这一技术瓶颈，吉林大学研究团队在《Talanta》发表论文，报道了一种新型远红外荧光探针DDAO-CT，实现对微塑料诱导肝损伤的动态可视化监测。

关键技术方法涉及探针设计合成、光谱表征、细胞实验和小鼠模型验证。研究基于远红外荧光团DDAO（9,9-二甲基-2(9H)-吖啶酮衍生物）构建探针，采用4-溴丁酰基作为识别基团，通过酯化反应合成DDAO-CT。利用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱评估探针性能，在肝细胞系和小鼠模型中验证其对糜蛋白酶活性的响应特性。

Probe design strategy

研究团队设计了一种基于分子内电荷转移（ICT）调控机制的智能探针。DDAO-CT由远红外荧光团DDAO和4-溴丁酰基识别基团组成，后者与DDAO的羟基酯化后破坏ICT过程，导致荧光淬灭。当糜蛋白酶特异性水解酯键后，探针恢复ICT特性，在674 nm处产生强荧光信号。这种"off-on"响应模式使探针具有高信噪比和特异性。

Materials and instruments

实验采用标准化学试剂和仪器设备，详细信息见补充材料。探针合成路线明确，通过核磁共振氢谱（¹H NMR）和高分辨质谱（HRMS）确认结构。

Synthesis of the probe

合成过程以4-溴丁酸为原料，在DMF催化下与硫酰氯反应制备4-溴丁酰氯，再与DDAO发生酯化反应得到目标产物。合成路线简洁高效，产率理想，为后续生物学应用奠定基础。

光学性能与选择性验证

DDAO-CT在酶解反应后展现14倍荧光增强，检测限达3.5 ng/mL。探针对糜蛋白酶表现出高度选择性，常见生物硫醇和活性氧物种不产生明显干扰。细胞实验证实，探针能有效监测肝细胞内糜蛋白酶活性变化，且细胞毒性低，生物相容性良好。

微塑料暴露模型验证

在PS微塑料处理的肝细胞中，探针检测到显著增强的荧光信号，表明糜蛋白酶激活与微塑料暴露存在直接关联。活体成像结果显示，小鼠肝脏荧光强度与微塑料暴露剂量呈正相关，且与组织病理学损伤程度高度一致。这一发现首次从酶活性层面证实糜蛋白酶上调是PS生物累积的下游事件。

结论与讨论

本研究成功开发出首个用于微塑料肝损伤动态可视化的远红外荧光探针DDAO-CT。探针通过ICT调控机制实现糜蛋白酶活性的高灵敏检测，其远红外发射特性（674 nm）有效克服组织穿透限制。实验证明微塑料暴露可通过生物累积效应激活糜蛋白酶，这一发现为理解环境污染物肝毒性机制提供新视角。该研究不仅建立了一种非侵入性评估环境肝毒素的新平台，更为酶水平解析微塑料肝损伤通路奠定方法学基础，对环境污染与健康风险预警具有重要意义。