综述：ATP、ADP和AMP分析在诊断应用中的进展：分析策略的最新进展

《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：ATP, ADP and AMP profiling for diagnostic applications: Recent advances in analytical strategies

本综述系统评述了腺苷酸化合物（ATP、ADP、AMP）作为细胞能量代谢核心指标的分析策略挑战与进展。重点探讨了样本制备（如高氯酸沉淀）与液相色谱（LC-UV/MS）等分析技术，并指出传统方法在捕获体内动态代谢方面的局限。文章特别强调了新兴的微创技术，尤其是活体固相微萃取（SPME）在实现近实时监测方面的潜力，为能量代谢相关疾病的诊断工具开发提供了重要方向。

腺苷酸分析在诊断应用中的挑战与进展

摘要

腺苷酸化合物——三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP）——是细胞能量代谢的核心调节者，也是生理和病理状态的重要生物标志物。它们快速的相互转化和酶不稳定性使得准确定量极具挑战性，尤其是在复杂的生物基质中。本综述总结了ATP、ADP和AMP的分析策略，重点关注生物系统中的样本制备和分析方法学。

1. 引言

腺苷酸化合物构成了细胞能量代谢的核心。这三种核苷酸通过酶促转化功能相连，维持细胞能量平衡并促进对代谢需求的快速适应。ATP是主要的能量货币，在能量依赖过程（如主动运输、信号转导和大分子生物合成）中持续转化为ADP和AMP。腺苷酸激酶和其他调节酶介导这些化合物的相互转化，维持着称为腺苷酸能量电荷的稳定比率——这是细胞生物能量状态的一个敏感指标。尽管其他嘌呤核苷酸（如GTP和环磷酸腺苷cAMP）也在信号传导中起关键作用，但ATP-ADP-AMP三联体因其丰度、快速互变和调节意义（包括其对AMPK信号和线粒体功能等通路的影响）而独特地捕捉了能量周转的动态。此外，这三种腺苷酸相对浓度的变化常常先于结构性或不可逆的代谢改变，使它们成为生理和病理状态的关键早期标志物。

然而，生物样本中腺苷酸的测定仍然存在分析挑战，这源于它们的高极性、内部不稳定性以及在样本处理过程中对酶促降解或转化的敏感性。这些特性要求仔细优化样本制备流程，以保留ATP、ADP和AMP的天然组成，同时最小化人为改变。

2. 组织腺苷酸分析在理解生理和疾病中的作用

尽管ATP、ADP和AMP的定量在多种生物基质（包括血液、脑脊液和培养细胞）中都具有相关性，但组织由于其代谢异质性、结构复杂性和有限的通达性而值得特别关注。组织代表了所研究生物系统的整合生理状态，包含了灌注、氧合和酶活性的区域梯度。跨器官的腺苷酸谱反映了特定组织的潜在代谢需求和适应能力。

例如，心脏体现了高吞吐量的能量代谢，ATP消耗率位居体内最高。腺苷酸水平的严格调节对于维持收缩性和电传导至关重要，即使是短暂的缺血事件也会导致ATP:ADP:AMP比率的快速转变——这些变化先于不可逆损伤，并可能作为心脏应激的早期指标。同样，骨骼肌在运动、疲劳或代谢性肌病期间经历腺苷酸平衡的巨大、暂时性波动，AMP的积累作为AMPK依赖性适应（包括增加葡萄糖摄取和线粒体生物合成）的关键触发因素。在大脑中，氧化磷酸化与神经元活动之间的紧密耦合使得ATP稳态对缺氧、中风或神经退行性变特别敏感。

总体而言，ATP-ADP-AMP三联体作为一个动态的、组织特异性的代谢稳态、信号活性和疾病易感性的指标。因此，组织腺苷酸分析为了解器官的生理和病理状态提供了一个独特的窗口，前提是它得到能够保留内源性代谢物水平和捕捉真实生物变异性的分析策略的支持。

3. 腺苷酸分析的分析技术

由于腺苷酸化合物的高极性、不稳定性和酶不稳定性，必须仔细优化分析流程以确保化合物稳定性和准确定量。多年来，已经探索了众多策略来应对这些挑战。

3.1. 基于液相色谱的技术

色谱技术为ATP及其代谢物的定量提供了关键优势。然而，其分析也存在一些挑战和局限性。主要困难之一源于腺苷酸化合物的化学结构：作为仅磷酸基团数目不同的磷酸化化合物，它们表现出与LC系统金属组分相互作用的强烈倾向，导致信号抑制、峰拖尾和重现性差。另一个担忧是它们在离子源中的有限稳定性和降解，尤其是在质谱（MS）分析期间，ATP特别容易发生此类降解。此外，腺苷酸是高度极性的，ATP、ADP和AMP的logP值分别为–5.5、–4.8和–4.7。

当前文献表明，紫外（UV）和质谱（MS）检测都是常用的解决方案。UV检测是一种易于获取且成本效益高的方法，特别适用于常规应用；然而，其相对较低的灵敏度限制了其在低丰度分析物中的应用。与MS检测相比，使用UV检测时的一个独特优势是它可以采用磷酸盐缓冲液作为流动相，这有助于最小化磷酸基团与金属离子的配位作用，改善色谱性能。

相比之下，当使用MS检测时，需要考虑不同的因素；鉴于不能使用磷酸盐缓冲液，需要替代策略来减轻磷酸盐-金属相互作用。一种方法包括在流动相中添加MS兼容的螯合剂，如EDTA或亚甲基二膦酸。然而，此类添加剂的使用必须仔细评估，因为它们可能导致离子抑制或保留时间偏移。

3.2. 非色谱检测策略

在非色谱方法中，生物发光法和生物传感器代表了ATP检测中最成熟和应用最广泛的策略，能够实现快速且在多数情况下是实时的测量。

生物发光技术是用于检测ATP的最古老和最广泛使用的方法之一。这些检测依赖于荧光素和荧光素酶在ATP和镁离子（Mg²⁺）存在下的酶促反应，产生与样品中ATP浓度直接成正比的光强。该领域持续的发展包括新型荧光素的发现、具有改进稳定性的荧光素酶的工程化以及为提高检测灵敏度进行的信号优化。

生物传感器是腺苷酸监测中另一个重要且广泛使用的策略，它能够实现小型化且通常是实时的分析。与生物发光方法类似，大多数生物传感器是为ATP检测而设计的，尽管有些也能区分ATP、ADP和AMP。这种选择性通常是通过监测生物传感器涂层与分析物之间相互作用强度的差异来实现的，这取决于它们含有一个、两个还是三个磷酸基团。

除了生物发光法和生物传感器，基质辅助激光解吸/电离（MALDI）-MS已被用作腺苷酸测定的非色谱方法。尽管在组织腺苷酸分析中不如色谱、生物发光或传感器方法常用，但MALDI在组织切片中ATP定位和代谢物成像方面的报道日益增多。

4. 生物基质中腺苷酸分析的样本制备策略

样本制备仍然是复杂生物基质中腺苷酸化合物监测的关键步骤。这一挑战源于ATP、ADP和AMP的持续相互转化、它们的快速酶促降解，以及需要保留天然浓度以获得实际生理状态的可靠信息。

报告的样本制备方案涵盖了广泛的基质，包括血液、血浆、尿液、肌肉组织和培养细胞，但大多数流程遵循类似的策略。主要方法是使用高氯酸进行蛋白质沉淀，它能快速灭活内源性酶（如外切核苷酸酶），随后中和酸性上清液以稳定分析物并保护LC系统。报告的中和剂包括碳酸钾、碳酸钠、磷酸氢二钾、氢氧化铵和碳酸氢钾。中和后，样品通常进行离心，并根据基质进行额外的过滤或冻干，以增强样品稳定性并去除干扰物。

除了体外方法，微透析已被研究用于细胞外腺苷酸代谢物的活体监测。该技术使用半透膜探针从组织间液中收集小分子，允许连续采样。然而，由于其主要位于细胞内、快速酶促降解和低细胞外浓度，将其用于直接ATP定量仍然有限。

总体而言，尽管已经报道了多种腺苷酸分析的样本制备策略，但使用冷高氯酸进行酸基蛋白质沉淀并随后快速中和仍然是体外研究中最有效和最广泛采用的方法。这种方法确保了快速酶灭活、高效蛋白质去除以及跨不同生物基质的高提取回收率，同时保持与色谱系统的兼容性。

5. 腺苷酸定量的分析挑战与未来方向

5.1. 方法学局限性与新兴需求

尽管取得了显著进展，但当前的腺苷酸分析方法仍面临关键局限，凸显了普遍有效策略的缺失。样本制备和分析方法学都需要进一步改进，特别是在动态生物系统中分析ATP-ADP-AMP三联体时。

越来越需要简化的、集成的平台，能够在时间敏感条件下提供ATP、ADP和AMP的快速可靠测量。两种广泛采用的策略——基于生物发光的方法和多样的生物传感器技术——构成了ATP定量的框架，并在床旁诊断方面展现出前景，但范围仍然有限。最值得注意的是，它们大多局限于ATP检测，无法提供关于ADP和AMP的全面信息。

就色谱技术而言，不同的因素决定了它们对腺苷酸监测的适用性。尽管已经开发了许多液相色谱（LC）方法与各种检测器联用，用于同时测定ATP、ADP和AMP，但这组分析物仍然存在显著的分析挑战。

几乎所有腺苷酸分析策略共有的另一个主要障碍是方法学标准化的缺乏。定量结果通常严重依赖于基质特异性校准、提取回收率和标准化方案，这些在不同实验室之间可能存在很大差异。

5.2. 用于内源性代谢物活体化学活检的固相微萃取

为了克服传统方法的局限性，腺苷酸分析的一个有前景的方向在于开发将非破坏性采样与直接活体化学分析相结合的集成平台。此类工具能够实现实时、微创的数据采集，同时保持组织的结构和生化完整性。

在新兴的分析平台中，活体固相微萃取（SPME）代表了一种特别有前景的方法，用于在天然条件下直接从活体组织或生物体液中提取不稳定的化合物，如ATP、ADP和AMP。活体SPME的操作类似于基于传感器的策略，因为它依赖于分析物在吸附相上的非 exhaustive 富集。然而，它不是提供即时读数，而是将富集与高效分离和质谱仪器相结合，从而实现多组分定量。

除了活体提取的优势和腺苷酸化合物定量的潜力外，同样重要的是要强调SPME在其耦合策略方面提供了灵活性。根据分析目标，SPME可以与多种常压和基于接口的电离技术集成，例如涂层刀片喷雾（CBS）和微流控开放接口（MOI）。

6. 结论

腺苷酸（尤其是ATP、ADP和AMP）的分析定量对于细胞能量代谢和代谢调节的研究仍然至关重要。作为不稳定且快速周转的分子，它们的测量需要仔细考虑分析准确性和生物学背景。

展望未来，腺苷酸分析的未来进展可能涉及互补技术的集成，例如将活体SPME与实时生物传感和小型化检测平台相结合，从而实现快速、空间分辨和微创的监测。涂层化学、设备几何形状和分析仪器的持续改进有望提高灵敏度、选择性和通量，从而实现对富能化合物更精确的分析。

值得注意的是，它们成功实施将越来越依赖于这些技术从实验概念验证到实际诊断应用的转化能力。除了技术优化，实现临床适用性还将取决于分析性能与医疗需求、监管框架和可持续实施模式的一致性。在此背景下，腺苷酸监测作为评估跨多种病理的细胞能量代谢的诊断工具具有巨大前景。在开发精确、微创和实时分析平台方面的持续进展，对于弥合实验室创新与临床转化之间的差距至关重要，最终实现更个性化和响应迅速的诊断。