综述：理解间充质干细胞干性的分子基础：对临床应用的启示

本综述系统阐述了间充质干细胞（MSC）干性的分子调控网络，涵盖转录因子、表观遗传调控（如m6A修饰）、非编码RNA（miRNA、lncRNA、circRNA）及线粒体功能等关键机制，并探讨了体外扩增中维持干细胞干性的策略，为提升MSC基于疗法的临床转化潜力提供了重要见解。

　　

引言

间充质干细胞（MSC）因其多向分化潜能、免疫调节特性及分泌组功能，已成为临床治疗超过30种疾病的重要工具，相关临床试验已超过1500项。然而，MSC的“干性”——即其维持未分化状态、自我更新和多向分化能力的本质——的分子基础仍知之甚少。这种认知差距极大地阻碍了MSC研究成果向成功临床应用的转化，其根本原因在于作用机制不明确。越来越多的证据表明，多种遗传因素精细地调控着MSC的自我更新和分化。本综述旨在深入探讨调控MSC干性的分子基础，为改进MSC基于疗法提供见解。

调控MSC干性的遗传因子

转录因子

转录因子（TF）通过结合靶基因上游调控元件，在调控MSC干性中发挥核心作用。

• ••
  Twist家族基因：Twist1和Twist2在MSC中高表达，其过表达能增强STRO-1（一种干性标志物）表达，促进增殖和成脂分化，但抑制成骨和成软骨分化。Twist1通过增加EZH2，进而通过H3K27me3修饰沉默衰老基因p14和p16，从而抑制MSC衰老。
  
• ••
  HOX家族基因：HOX基因形成稳定的“HOX代码”，可反映MSC的组织来源。例如，HOXA5促进牙髓MSC的成骨分化和增殖，其缺失会通过上调p16^INK4a和p18^INK4c诱导细胞周期停滞。
• ••
  OCT4：OCT4（特别是OCT4A亚型）的表达受血清成分、低氧培养和传代次数影响。其过表达可促进MSC增殖、集落形成单位（CFU-F）和成软骨分化。在人类毛囊MSC中，OCT4通过上调DNMT1来抑制p21，从而增强细胞周期进程和成骨分化。
• ••
  SOX家族基因：SOX2在体外扩增过程中减少，其敲低会导致c-MYC减少。SOX2直接上调DKK1，从而拮抗WNT信号通路。此外，SOX2还以YAP1为靶点，影响Hippo通路。
  
• ••
  Krüppel样因子家族基因：KLF2通过正调控多能性标志物（OCT4、Nanog和Rex1）来增强MSC增殖并维持未分化状态。KLF4通过直接结合WNT信号通路中的FZD1等，维持MSC的未分化状态。
• ••
  T-box家族基因：Tbx3的表达随体外扩增而降低，其敲低会减少MSC增殖并减慢成骨分化。TBX3通过抑制p14^ARF和p16^INK4a来调节细胞衰老。
• ••
  AP-1家族转录因子：c-Maf直接结合OCT4、Nanog、Sox2和c-MYC等基因的启动子，调控hAD-MSC的增殖和多能性。
• ••
  REX1：作为多能性标志物，REX1通过直接结合p38 MAPK的上游调节因子MKK3来发挥其对MSC干性的作用。

细胞周期调节因子的作用

细胞周期进程的调节对于维持MSC干性至关重要。p53作为“基因组守护者”，其敲除可增加MSC的增殖和CFU-F形成，但会改变其分化和基因组稳定性。核干细胞素（NS）是增殖MSC的标志物，其表达随分化和衰老而下降。BMI1通过抑制INK4a/ARF位点来促进细胞周期进程并调节衰老。视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）通过上调DNMT1来维持MSC的增殖和分化潜能。

保障MSC基因组完整性的基因组稳定性基因

基因组的稳定性对MSC干性至关重要。MSC在体外扩增过程中会积累DNA损伤，导致分化潜能显著下降。端粒长度和端粒酶活性也与MSC的寿命和分化能力密切相关。人端粒酶逆转录酶（hTERT）的过表达可延长MSC的寿命并维持其成骨潜能。此外，一部分MSC可能激活端粒延长替代机制（ALT）来维持端粒长度，但这常与基因组不稳定性相关。

影响MSC干性的细胞质量控机制

细胞质量控机制，包括未折叠蛋白反应（UPR）和热休克蛋白（HSP），通过重新折叠、降解或将错误蛋白递送至不同的质量控区室来减少缺陷蛋白的产生。

• ••
  未折叠蛋白反应：UPR在应对内质网（ER）应激时被激活。骨形态发生蛋白2（BMP2）通过激活PERK、OASIS、IRE1α和ATF6等UPR传感器诱导MSC成骨分化。例如，PERK-eIF2α-ATF4信号通路在ER应激响应中调节成骨细胞分化。
  
• ••
  热休克蛋白：HSP90通过下调膜TLR-4和ErbB2受体激活下游PI3K/Akt和ERK1/2通路，增强MSC活力并保护其免受血清剥夺和缺氧诱导的凋亡。热休克蛋白70（HSP70）对于MSC的成骨和成软骨分化至关重要。

表观遗传调控

表观遗传修饰，包括DNA甲基化、组蛋白修饰和m⁶A RNA甲基化，在不改变DNA序列的情况下，在染色质和转录水平调控MSC的自我更新和分化。

• ••
  DNA甲基化：MSC的全球DNA甲基化景观在衰老过程中发生变化。DNMT抑制剂（如RG108、5-氮杂胞苷）可通过诱导表观遗传激活（如NANOG和OCT4）来维持MSC干性。
• ••
  组蛋白修饰：
  • ••
    组蛋白甲基化：EZH2（一种组蛋白甲基转移酶）促进成脂分化但抑制成骨分化。EZH2是TWIST1的下游靶标，通过H3K27me3抑制Ink4A/Arf位点。
  • ••
    组蛋白去甲基化：KDM3A和KDM4C等H3K9去甲基酶与MSC衰老负相关，其过表达可促进异染色质重组并减少DNA损伤反应。
  • ••
    组蛋白乙酰化/去乙酰化：组蛋白乙酰转移酶p300的抑制会诱导早衰。SIRT1通过去乙酰化SOX2并促进其蛋白酶体降解，从而维持BM-MSC的自我更新能力。SIRT1还负调控p16和p21，并正调控端粒酶活性。
• ••
  m⁶A修饰：m⁶A甲基转移酶METTL3在BM-MSC成骨分化过程中减少，并通过Akt磷酸化调控MSC分化和存活。m⁶A去甲基酶ALKBH5通过m⁶A依赖性方式调控CYP1B1或CDKN1C等靶标mRNA的稳定性，从而影响MSC衰老，其作用具有细胞来源特异性。

非编码RNA在MSC干性中的作用

非编码RNA，包括microRNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）和环状RNA（circRNA），是重要的调控分子。

• ••
  miRNA：miRNA作为分子开关，通过转录后调控靶基因表达来影响MSC命运。例如，miR-10a通过抑制KLF4减少细胞衰老并改善三系分化；miR-21通过抑制SOX2调节MSC干性；miR-335过表达通过抑制AP-1活性导致MSC早衰。
  
• ••
  长链非编码RNA：lncRNA HOTAIR通过三螺旋形成靶向基因组特定位点来调节MSC增殖和分化。lncTCF7通过激活Wnt信号通路维持MSC的干细胞样状态。
• ••
  环状RNA：circFOXP1通过与miR-17-3p/miR-127-5p直接相互作用，减缓MSC分化。CDR1as的敲低会降低hUC-MSC的增殖、干性相关基因表达和分化潜能。许多circRNA通过充当miRNA海绵或与其他分子相互作用，在MSC成骨分化中发挥重要作用。

线粒体功能在调控MSC干性中的作用

线粒体功能通过调节细胞能量代谢和氧化应激状态，在MSC干性中扮演关键角色。SIRT1、SIRT3等线粒体相关去乙酰化酶通过影响线粒体生物发生和抗氧化反应来调节MSC稳态和分化。代谢状态（糖酵解与氧化磷酸化的平衡）深刻影响MSC干性，未分化的MSC更倾向于依赖糖酵解。

影响MSC干性的生长因子

生长因子如成纤维细胞生长因子（FGF）、肝细胞生长因子（HGF）、干细胞因子（SCF）和胰岛素样生长因子1（IGF1）在维持MSC干性、促进增殖和影响分化方向方面发挥重要作用。

体外扩增期间维持MSC干性的策略

• ••
  MSC来源的选择：不同组织来源的MSC（如骨髓来源MSC（BM-MSC）、脂肪来源MSC（AD-MSC）、脐带来源MSC（UC-MSC））在增殖、分化潜能和免疫调节功能上存在差异。诱导多能干细胞来源的MSC（iPSC-MSC）提供了无限来源，并具有 rejuvenated 状态，但功能上可能与原代MSC有所不同。
• ••
  利用scRNA-seq解析MSC异质性：单细胞RNA测序（scRNA-seq）有助于识别具有特定功能（如高干性、强免疫调节或成骨能力）的MSC亚群及其标志物。
• ••
  调节MSC中特定基因表达以保持干性：通过基因操作过表达干性相关转录因子（如OCT4、NANOG）、生长因子（如FGF2、IGF1）或抗应激蛋白（如HSP20、HSP27），可以增强MSC的增殖、分化潜能和抗凋亡能力。CRISPR-Cas9等技术为更安全的基因编辑提供了可能。
• ••
  永生化：通过过表达hTERT、c-MYC或SV40T等基因可使MSC绕过衰老，获得无限增殖能力，但需仔细评估其安全性。
• ••
  工程化MSC微环境：细胞外基质（ECM）成分，如硫酸乙酰肝素（HS）和透明质酸，通过调节生长因子信号（如FGF信号）影响MSC行为。
• ••
  优化的培养条件：使用无血清/无异种成分培养基、三维（3D）球体培养、低氧环境、地塞米松预处理或特定小分子（如乳酸钠）等条件，有助于在体外扩增过程中更好地维持MSC干性和功能。
• ••
  低氧环境：低氧通过上调缺氧诱导因子（HIF），下调p16和ERK，或直接下调E2A-p21，维持MSC的未分化状态和自我更新能力。
• ••
  MSC来源的细胞外囊泡：MSC-EVs作为细胞游离疗法，具有较低的免疫原性，并能携带多种生物活性分子，模拟亲本细胞的治疗作用，同时避免活细胞移植的相关风险。

结论

MSC是基于细胞的再生医学中应用最广泛的干细胞类型之一。对MSC干性分子机制的深入理解，是开发更安全、有效疗法的基础。这有助于避免使用过度传代或功能异常的MSC，提高细胞在体内的存活和归巢能力，确保细胞产品质量和批次间一致性，精确控制其向特定谱系分化，优化体外扩增方案，增强其免疫调节功能，并指导基于MSC分泌组或细胞外囊泡（EV）的无细胞疗法开发。尽管iPSC-MSC等新来源展现出潜力，但其伦理和安全性问题仍需谨慎对待。利用scRNA-seq等先进技术鉴定可靠的干性生物标志物，以及继续深入研究MSC干性的调控网络，对于推动MSC临床应用的未来发展至关重要。