温度敏感型CRISPR-Cas12a系统为昆虫不育技术提供新型单株系解决方案

《Nature Communications》：A temperature-sensitive CRISPR-Cas12a system for sterile insect technique

本研究针对传统昆虫不育技术(SIT)中双株系维持和性别分选难题，开发了一种基于温度敏感型Cas12a核酸酶的精准导向昆虫不育技术(pgSIT)。研究人员在果蝇中构建了同时携带Cas12a核酸酶及靶向雄性不育基因β-tubulin和雌性致死基因sex lethal的gRNA的单株系，该株系在18℃可稳定维持混合性别群体，升温至29℃后可在一代内产生完全不育雄性和致死雌性。该系统显著简化了pgSIT操作流程，为病媒控制和农业害虫治理提供了更可扩展的技术平台。

　　

在抗击蚊媒传染病的斗争中，昆虫不育技术(Sterile Insect Technique, SIT)一直是一种重要的生物防治手段。传统SIT通过释放大量绝育的雄虫，使其与野生雌虫交配后无法产生可存活的后代，从而达到控制种群数量的目的。然而，现有的SIT方法存在明显局限：辐射绝育的雄虫交配竞争力下降，Wolbachia不相容技术需要稳定感染且存在雌虫意外释放风险，携带显性致死基因(RIDL)的方法则需要使用抗生素维持种群。更棘手的是，所有这些方法都需要在释放前进行精确的性别分选，避免雌虫污染，这一过程既耗时又容易出错。

随着CRISPR基因编辑技术的出现，精准导向昆虫不育技术(precision-guided SIT, pgSIT)应运而生。这种技术通过将表达Cas9核酸酶的株系与表达引导RNA(gRNA)的株系进行遗传杂交，产生特异性的不育雄虫。但现有的pgSIT同样需要分别维持两个亲本株系，并进行繁琐的性别分选和杂交步骤，大大增加了操作复杂度和规模化应用的难度。

面对这一挑战，研究人员将目光投向了具有温度敏感特性的Cas12a核酸酶。与持续活跃的Cas9不同，Cas12a在低温下活性很低甚至无活性，而在高温下活性显著增强。这一特性启发研究团队思考：能否利用Cas12a的温度敏感性，开发一种单株系的pgSIT系统，避免复杂的株系维持和性别分选过程？

在《Nature Communications》发表的最新研究中，Christina Nguyen等人成功开发了这样一种温度敏感的CRISPR-Cas12a系统。他们针对果蝇的性别决定和生育相关基因，设计了一套创新的遗传控制策略，使得单一种群可以在低温下稳定维持，而在需要时通过简单升温即可快速产生大量不育雄虫。

为开展这项研究，作者团队运用了几个关键技术方法：利用PhiC31整合酶系统构建转基因果蝇品系；采用深度测序分析Cas12a在不同温度下的基因编辑效率；通过单对交配实验评估雄性不育和雌性致死效果；设计优化型gRNA阵列提升编辑特异性；建立三重转基因组装系统实现单株系维持。实验对象为黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，所有株系均在实验室条件下培育和测试。

研究团队首先设计了靶向四个关键基因的gRNA构建体：β-微管蛋白(β-tubulin, βtub)基因，该基因特异性表达于睾丸，突变后导致雄性不育；性别致死(sex lethal, sxl)基因，其破坏引起雌性致死；转换器(transformer, tra)和双性(double sex, dsx)基因，针对这些基因的女性特异性转录本可产生间性个体。

Cas12a产生温度依赖的雄性不育和雌性致死

研究人员首先测试了Cas12a系统在靶向βtub和sxl基因时的温度敏感性。将表达Cas12a的雌性与表达βtub-gRNA的雄性杂交后，在29℃下G1代雄性与野生型雌性交配不产生任何后代，而在18℃下则保持完全可育。深度测序分析显示，在18℃时几乎所有gRNA的编辑率都很低(0-2%)，而在29℃时编辑效率显著提高。

类似的，靶向sxl基因的实验表明，在29℃下携带Cas12a和sxl-gRNA的雌性完全不能存活至成虫期，而在18℃下虽有雌性存活但不能繁殖。分子分析证实这些表型与gRNA在不同温度下的编辑活性密切相关。

Cas12a通过靶向tra和dsx基因温度依赖地产生间性个体

为了构建更完善的pgSIT系统，研究团队进一步测试了tra和dsx基因。在29℃下，靶向tra基因产生了 exclusively 雄性和间性个体，而靶向dsx基因也显示出相似趋势。温度升高显著提高了这些gRNA的编辑效率，从18℃时的低活性(4-8%)提升至29℃时的高效率(43-86%)。

优化gRNA提升低温下的双转基因组装能力

针对初始构建体中某些gRNA在低温下仍有活性的问题，研究团队开发了优化版本，仅保留在18℃下完全无活性而在29℃下高效的gRNA。优化后的βtub构建体(含两个gRNA)和sxl构建体(含两个gRNA)在低温下几乎无编辑活性，而在高温下编辑效率反而比四gRNA构建体更高，表明减少gRNA数量可能减轻对Cas12a的竞争性结合。

最重要的是，优化后的构建体成功实现了与Cas12a在18℃下的稳定共存，βtub双转基因株系已维持10代(超过7个月)，为三重转基因系统的构建奠定了基础。

三重转基因Cas12a系统通过温度转换诱导雄性绝育和雌性致死

研究人员将Cas12a(整合于X染色体)、优化βtub-gRNA(第二染色体)和优化sxl-gRNA(第三染色体)三个转基因成功组装到单个个体中。该三重转基因株系在18℃下可稳定维持混合性别种群超过4代，性别比例始终保持在约1:1。

当将种群从18℃转移至29℃后，G1代中完全不出现三重转基因雌性，而所有G1代三重转基因雄性在与野生型雌性交配时均显示完全不育。这表明单次温度转换即可在一代内实现雌性致死和雄性绝育。

生育力和竞争力评估

对各转基因株系在三个温度(18℃、25℃、29℃)下的关键发育和生殖参数评估显示，三重转基因株系在大多数参数上与对照株系表现相当，除了幼虫孵化率有所降低(约60%)。在29℃时，由于完全的雌性致死，幼虫至成虫的成功率降至约50%。

特别重要的是，在25℃下进行的交配竞争实验表明，pgSIT雄性能有效与野生型雄性竞争。在混合种群(2只野生型雄性+2只pgSIT雄性+10只野生型雌性)条件下，产卵量比对照(仅野生型)减少32%，孵化率也从48%降至37%。而在仅含pgSIT雄性的条件下，几乎不产卵，证实了pgSIT雄性的强烈绝育效果。

讨论与结论

本研究成功证明了温度敏感型Cas12a系统在pgSIT中的应用可行性。与需要复杂温度诱导系统的传统方法不同，该系统直接利用Cas12a蛋白本身的温度敏感性，实现了更快速、更直接的表型调控。通过优化gRNA设计，研究人员解决了初始构建体在低温下仍有残留活性的问题，最终实现了三重转基因单株系的长期稳定维持。

该系统的核心优势在于极大简化了pgSIT的操作流程。传统pgSIT需要分别维持两个亲本株系并进行性别分选和杂交，而本系统仅需维持一个混合性别株系，并通过简单温度转换即可快速产生大量不育雄虫。这不仅降低了操作复杂度和劳动力成本，也减少了因性别分选错误导致的雌虫污染风险。

值得注意的是，与之前基于Cas9的pgSIT系统主要影响孵化率不同，本系统中的pgSIT雄虫还显著降低了雌虫的产卵量，这可能源于更彻底的βtub基因破坏影响了雄性附腺功能，进而干扰了雌虫的交配后反应。这为种群抑制提供了额外的作用机制。

尽管本研究在果蝇中完成，但温度敏感型Cas12a系统的设计原理具有广泛适用性。未来研究将探索该系统在重要农业害虫(如斑翅果蝇)和病媒蚊虫(如登革热媒介埃及伊蚊)中的应用潜力。同时，通过将多个转基因元件整合到单个遗传单元中，可以进一步减少对昆虫适应性的潜在影响。

这项研究为昆虫种群控制提供了一种创新策略，将温度敏感性与CRISPR基因编辑技术巧妙结合，解决了现有pgSIT技术面临的主要操作难题，为下一代遗传防治工具的开发奠定了重要基础。随着进一步优化和适应性测试，这种温度调控的Cas12a-pgSIT系统有望在农业害虫管理和蚊媒传染病控制中发挥重要作用。