位点特异性连接酶依赖偶联联合开环连接子技术提升HER2靶向ADC的安全性与稳定性

《Nature Communications》：Site-specific ligase-dependent conjugation with ring-opening linker improves safety and stability of HER2-targeting ADCs

本研究针对当前抗体药物偶联物（ADC）因随机偶联和不稳定连接子导致的异质性及载荷介导的脱靶毒性问题，开发了基于位点特异性连接酶依赖偶联（LDC）技术和稳定开环连接子的新型ADC药物GQ1001（靶向HER2的抗体偶联DM1）和GQ1005（偶联DXd）。研究通过体外活性筛选、体内荷瘤模型药效评价、药代动力学和毒理学分析，证实二者在保持抗肿瘤活性的同时，显著降低血浆中游离毒素暴露，提升治疗窗口，且在T-DXd耐药（高表达ABCG2）模型中仍有效。该技术为改善ADC的稳定性和安全性提供了新策略，对难治性HER2阳性癌症治疗具有重要临床意义。

　　

抗体药物偶联物（Antibody-Drug Conjugate, ADC）作为肿瘤靶向治疗的重要方向，通过将特异性单克隆抗体与高效细胞毒性药物偶联，实现精准杀伤肿瘤细胞。然而，传统ADC技术存在两大瓶颈：一是基于半胱氨酸或赖氨酸的随机偶联方式导致药物-抗体比值（Drug-to-Antibody Ratio, DAR）分布不均，产生高度异质性；二是常用的马来酰亚胺连接子在体内易发生逆迈克尔加成或巯基交换反应，造成载荷提前释放，引发脱靶毒性。例如，已上市的抗HER2 ADC药物T-DM1和T-DXd虽在临床上取得一定成功，但其连接子稳定性不足限制了疗效提升和毒性控制。

为解决上述问题，来自海军军医大学附属长海医院、复旦大学附属肿瘤医院等机构的研究团队在《Nature Communications》发表最新研究，提出一种创新性ADC构建策略：结合位点特异性连接酶依赖偶联（Ligase-Dependent Conjugation, LDC）技术与稳定开环连接子，开发出新一代HER2靶向ADC药物GQ1001（偶联DM1）和GQ1005（偶联DXd）。该技术通过工程化Sortase A酶介导的定点偶联，确保DAR高度均一（DAR=2占比达99%），并利用预偶联阶段完成硫代琥珀酰亚胺结构的开环反应，从根本上避免不稳定结构的形成，显著提升血浆稳定性。

关键技术方法概述

研究采用酶固定化技术将工程化Sortase A预装于层析柱，实现单步流穿式ADC连续生产。通过疏水相互作用色谱（HIC）-高效液相色谱（HPLC）和肽图谱法分别验证DAR均一性和偶联位点准确性。体外活性实验涵盖多种HER2高/低表达肿瘤细胞系；体内药效评价基于细胞源性异种移植（CDX）和患者源性异种移植（PDX）模型；药代动力学/毒代动力学研究在大鼠和食蟹猴中开展，并通过液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）检测游离毒素浓度。

研究结果

结构设计与表征

GQ1001的 linker-payload（P31-DM1-α）在弱碱性条件下发生预偶联开环，生成带羧基的亲水性连接子，避免硫代琥珀酰亚胺结构的形成。

LDC技术实现单抗与 linker-payload 的定点偶联，产物单体纯度超99%，且能在2-8°C稳定保存36个月。

体外药效与机制

GQ1001对HER2高表达细胞（如HCC1954、NCI-N87）的半数抑制浓度（IC₅₀）达纳摩尔级别，且活性显著高于游离DM1或抗体与 linker-payload 的简单混合。值得注意的是，在HER2阴性MDA-MB-468细胞中，GQ1001即使浓度高达100 nM仍无显著毒性，而T-DM1的IC₅₀为10.55 nM，表明其作用具有严格的HER2依赖性。

50: 10.55 nM).(B) Cell cycle and(C) apoptosis(measured by activation of Caspase-3/7) of HER2-amplified and HER2-negative cancer cells. A-C performed three times. For HER2-'>细胞周期与凋亡实验进一步显示，GQ1001可浓度依赖性诱导HER2阳性细胞G₂/M期阻滞和Caspase-3/7活化，但对HER2阴性细胞无影响。

体内抗肿瘤效果

在多种HER2阳性CDX（如BT474乳腺癌模型）和PDX模型（包括胃癌、胆管癌、结直肠癌和肺癌）中，单次或多次给予GQ1001（1.25-10 mg/kg）可显著抑制肿瘤生长，疗效与T-DM1相当甚至更优。

尤其值得注意的是，在因ABCG2高表达而对T-DXd耐药的模型中，GQ1001仍能有效抑制肿瘤生长，其活性代谢物K'-MCC'-DM1并非ABCG2主要底物，从而规避了该耐药机制。

药代动力学与安全性优势

食蟹猴中，GQ1001给药后血浆游离DM1的峰浓度（C_max）和药时曲线下面积（AUC）较T-DM1降低超99%（30 mg/kg剂量下，AUC相差逾50万倍）。

体外血浆稳定性实验显示，GQ1001的DM1脱落率仅为T-DM1的1/100（96小时时0.11% vs 11.84%）。毒理学研究中，GQ1001的最高非严重毒性剂量（HNSTD）达45 mg/kg（T-DM1为10 mg/kg），且未观察到神经系统毒性等不可逆损伤。

联合治疗潜力

GQ1001与HER2靶向酪氨酸激酶抑制剂（TKI，如吡咯替尼、图卡替尼）或化疗药物（紫杉醇、卡培他滨）联用，在多种PDX模型中显示出协同抗肿瘤效果，甚至优于当前标准方案（曲妥珠单抗+帕妥珠单抗+化疗）。

GQ1005的稳定性与安全性验证

GQ1005（DAR=4）在人和食蟹猴血浆中DAR保持稳定，而T-DXd的DAR在96小时内下降约50%。

体内实验显示，GQ1005的肿瘤-血浆载荷暴露比显著高于T-DXd（198.5:1 vs 39.7:1），且HNSTD达60 mg/kg（T-DXd为30 mg/kg），未观察到肺毒性。

结论与意义

本研究通过LDC技术与开环连接子的创新结合，成功构建了高稳定性、低毒性的新一代ADC药物GQ1001和GQ1005。二者在保留抗肿瘤活性的同时，显著降低游离毒素暴露，拓宽治疗窗口，且对传统ADC耐药模型有效。该策略为突破ADC研发中的异质性和脱靶毒性瓶颈提供了切实可行的解决方案，有望为难治性HER2阳性肿瘤患者带来更安全有效的治疗选择。