无定形VHL基SMARCA2 PROTAC关键功能结构的确定——揭示大分子降解剂固态稳定化新机制

《Nature Communications》：Determination of key functional structures of an amorphous VHL-based SMARCA2 PROTAC

本研究针对难以结晶的PROTAC降解剂在无定形制剂中原子级结构不明的难题，通过核磁共振晶体学首次解析了VHL基SMARCA2 PROTAC的完整三维结构，发现其稳定化机制不同于小分子药物，主要依赖分子链段的构象熵贡献，为开发靶向"不可成药"蛋白的降解剂制剂提供了重要结构基础。

　　

在当今药物研发领域，靶向蛋白降解技术（PROTAC）正掀起一场革命。这类双功能分子能够将疾病相关靶点蛋白与E3连接酶拉近，促使靶蛋白被泛素化标记进而被蛋白酶体降解。与传统抑制剂相比，PROTAC的优势在于它不需要直接抑制靶蛋白的活性位点，而是利用细胞自身的降解机制来清除致病蛋白，这使得一些原本被认为"不可成药"的靶点成为了可能治疗的对象。目前已有20多种PROTAC化合物进入临床试验阶段，展现出巨大的治疗潜力。

然而，PROTAC分子在制剂开发过程中面临着一个严峻挑战：它们通常难以结晶，大多以无定形形式存在。无定形固体虽然避免了结晶的难题，但其原子级结构不明确，存在自发结构重排的风险，可能影响药物的生物利用度和稳定性。传统的结构解析手段如X射线衍射和冷冻电镜（cryo-EM）虽然能够解析PROTAC与蛋白质形成的三元复合物结构，但对纯固态无定形PROTAC却无能为力。这种结构信息的缺失严重制约了高效、稳定PROTAC制剂的设计与开发。

为了解决这一难题，来自瑞士洛桑联邦理工学院（EPFL）和阿斯利康的Daria Torodii、Jacob B. Holmes等研究人员在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们采用核磁共振（NMR）晶体学方法，首次在原子水平上解析了一种基于Von Hippel-Lindau（VHL）的SMARCA2 PROTAC（PROTAC 2）的无定形结构，揭示了其独特的稳定化机制。

研究人员主要运用了核磁共振晶体学技术，结合动态核极化（DNP）增强的固态核磁共振方法和分子动力学模拟，通过机器学习模型ShiftML2预测化学位移，对无定形PROTAC 2粉末样品进行了全面的结构表征。研究还使用了差示扫描量热法（DSC）测定玻璃化转变温度，并通过X射线衍射验证样品性质。

研究结果

NMR谱图指认

研究人员首先通过溶液态和固态NMR谱图的系统比较，成功指认了PROTAC 2无定形粉末中41个碳原子和31个氢原子的化学位移。由于分子较大（含48个碳原子和35个不等价质子），谱图存在严重重叠，研究团队采用变温NMR和DNP增强技术提高了检测灵敏度，并通过高斯拟合获得了各原子位点的化学位移分布。

最佳匹配结构筛选

通过分子动力学模拟生成372，864个候选结构，利用机器学习模型预测各结构的化学位移，并与实验值比较，筛选出5，000个与实验数据最吻合的结构（NMR集合）。这些结构不仅能量合理，而且能很好地再现实验观测到的化学位移分布。

结构 motif 分析

研究发现，PROTAC 2分子中存在一个显著 promoted 的分子内氢键相互作用（H1-N53），出现在80%的NMR集合分子中。这一氢键将酚环部分锁定在特定构象，使得SMARCA2结合区域相对有序。

与之前研究的无定形小分子药物AZD4625和Atuliflapon不同，PROTAC 2中分子间氢键相互作用不再是主要的稳定化机制。相反，研究团队提出，类似于玻璃态聚合物，PROTAC 2无定形形式的主要稳定化机制是整体柔韧性引入的熵贡献，特别是在分子的连接区域。

肽样区域构象分析

在VHL结合区域，五元脂肪环表现出广泛的二面角分布，表明该区域存在较大程度的无序。主链二面角分布显示三个峰值中心，与蛋白质中脯氨酸的构象分布相似但更为分散。有趣的是，在PROTAC 2与SMARCA和VHL形成的三元复合物中观察到的构象（PDB：6HAX）在无定形固体中较为罕见，表明结合过程中的氢键相互作用显著影响了PROTAC的构象偏好。

连接区域的高度无序性

对连接区域二面角（C20-C23-C26-C27）和原子间距离（C7-C26、C7-C50、C18-C39）的分析表明，该区域几乎完全无序，所有可能的构象和距离均有分布，没有明显的促进或抑制现象。这种高度柔韧性使得PROTAC 2的整体行为类似于玻璃态聚合物，其玻璃化转变温度（T_g约-105°C）与聚苯乙烯（约-100°C）等聚合物相似。

研究结论与意义

本研究首次在原子水平上解析了无定形PROTAC 2的完整结构，揭示了其三个功能单元具有截然不同的结构类型：SMARCA2结合区域有序度最高，由强分子内氢键（H1-N53）稳定；肽样VHL结合区域较为无序；连接区域则几乎完全无序。

与之前研究的小分子无定形药物不同，PROTAC 2的主要稳定化机制不是分子间氢键相互作用，而是整体柔韧性引入的熵贡献，特别是在连接区域。这种聚合物般的特性使得PROTAC 2的无定形形式能够通过构象熵来稳定，这一发现为理解大分子降解剂的固态行为提供了新视角。

研究还发现，无定形固体中PROTAC 2的最主要构象与其在蛋白质三元复合物中的构象存在显著差异，突显了环境对PROTAC构象的重要影响。这些发现不仅增进了对PROTAC无定形制剂稳定化机制的理解，也为设计更高效、更稳定的靶向蛋白降解剂提供了重要结构基础，特别是对于那些靶向传统"不可成药"蛋白的降解剂开发具有指导意义。

这项研究展示了NMR晶体学在解析复杂无定形药物结构方面的强大能力，为未来研究其他难以结晶的生物大分子制剂提供了可靠的方法学基础。随着更多PROTAC化合物进入临床开发阶段，对这种新型降解剂固态行为的深入理解将直接影响其制剂设计和临床应用前景。