综述：细胞外囊泡的生物发生、组成和释放的昼夜节律调控

《npj Biological Timing and Sleep》：Circadian regulation of extracellular vesicle biogenesis, composition, and release

本综述系统阐述了生物钟通过转录及转录后机制调控细胞外囊泡（EVs）的生物发生、 cargo 分选及释放的分子机理。文章强调了EVs释放和组成的昼夜波动在生理（如凝血、电解质平衡）及多种疾病（如癌症、心血管疾病）中的关键作用，并指出将采集时间标准化对提升EVs作为疾病诊断生物标志物（biomarker）可靠性至关重要。理解昼夜节律对EV生物学的调控，将为开发新型时间疗法（chronotherapy）开辟道路。

　　

昼夜节律调控细胞外囊泡生物学

细胞外囊泡（EVs）是细胞释放的脂质双层包裹的颗粒，无法自我复制，在细胞间通信、免疫调节等生理病理过程中扮演关键角色。近年研究发现，EVs的释放、大小和分子组成均存在显著的昼夜波动，这些变化受到内源性生物钟的精密调控。

哺乳动物生物钟的分子机制

生物钟的核心是由转录-翻译反馈环（TTFL）驱动的分子振荡器。CLOCK（或其旁系同源物NPAS2）与BMAL1异源二聚化后结合E-box，启动周期基因（Per）和隐花色素基因（Cry）等的转录。PER和CRY蛋白在胞质积累并经酪蛋白激酶1δ/ε（CK1δ/ε）等修饰后入核，抑制CLOCK:BMAL1的活性，形成负反馈环。此外，REV-ERBα/β和RORα/β/γ通过RORE元件调控Bmal1转录，构成辅助反馈环。翻译后修饰（如磷酸化、泛素化、乙酰化）则精细调控时钟蛋白的稳定性、亚细胞定位及活性，从而维持约24小时的节律周期。

细胞外囊泡的生物学

EVs主要分为外泌体（exosomes，起源于多泡体MVB）和微囊泡（microvesicles，由质膜出芽形成）。外泌体生物发生涉及内吞途径，早期内体成熟为晚期内体/MVB，其膜向内出芽形成腔内囊泡（ILV）。MVB最终与质膜融合释放ILV（即外泌体）。这一过程由ESCRT（内体分选复合物）依赖性和非依赖性途径（如鞘磷脂-神经酰胺途径）调控。Rab GTP酶和SNARE蛋白则介导MVB的运输与膜融合。

EV释放、大小和组成的昼夜变化

早在20世纪80年代，研究就发现大鼠胃壁细胞微囊泡的密度存在昼夜节律。临床观察显示，健康人循环中VCAM-1⁺微囊泡的数量在24小时内呈现显著变化。纳米流式细胞术分析进一步揭示，EV的大小和数量存在个体间差异，但普遍表现出昼夜波动。在病理状态下，如阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）患者循环中CD41⁺和Annexin V⁺微囊泡的数量在下午5点达到峰值，且此节律在持续气道正压（CPAP）治疗后减弱。肾脏缺血再灌注损伤模型中，尿液中小EV的排泄浓度在黑暗期（大鼠活动期）达到高峰。此外，尿液外泌体中钠氯协同转运蛋白（NCC）和prostasin的浓度也在下午3点左右出现峰值，与血压的昼夜调节相呼应。模拟夜班作息会导致血液外泌体中62种miRNA表达差异，其中10种显著变化，这些EV可破坏脂肪细胞中BMAL1的节律性。小鼠肌腱成纤维细胞释放的小EV的蛋白质组学分析发现，RNA结合蛋白和核糖体蛋白在上午6-10点达峰，而细胞骨架和细胞外基质蛋白在晚上10-11点达峰，表明EV cargo的装载存在时序分离。

EV通路相关基因的节律性表达

生物信息学分析（利用CircaDB等数据库）发现，参与EV生物发生和释放的多个基因转录本在小鼠和人体组织中呈现节律性表达。例如，ESCRT-0复合体亚基STAM1、ESCRT-I复合体亚基VPS28、TSG101、UBAP1，以及多个ESCRT-III复合体亚基（如CHMP1A/B, 2A/B, 4B/C, 5, 7）和VPS4B的mRNA均存在昼夜振荡。参与MVB运输和融合的Rab GTP酶（RAB2B, 5A, 5C, 7, 9A, 11A, 14, 22A, 27A/B, 35）和SNARE蛋白（VAMP7, SNAP23, YKT6）的表达也受昼夜节律调控。ESCRT非依赖性途径相关基因，如Flotillin-1（FLOT1）、FLOT2、ARF1和ARRDC1，同样显示节律性表达。

昼夜节律对EV生物学的多层级基因表达调控

昼夜节律对EV生物学的调控体现在基因表达的多個层面。通过对小鼠肝脏ChIP-seq、Nascent-seq和RNA-seq数据的分析发现，即使某些基因（如Vps37b）的成熟mRNA不呈现明显节律，其新生RNA的合成或核心时钟蛋白（如BMAL1、PER2）在其顺式调控区域的结合也可能存在昼夜波动。相反，有些基因（如Hgs）的成熟mRNA表现出强节律性，但其新生RNA合成或时钟蛋白结合却未检测到明显振荡。这揭示了转录、转录后处理等不同层级调控的复杂性。

结论

细胞外囊泡是细胞间通信的关键媒介，其生物发生、释放和功能受到内源性昼夜节律系统的精细调控。理解这种时空动态调控对于揭示EV在生理和病理过程中的作用至关重要，尤其有助于推动EV作为疾病生物标志物的标准化及其在时间疗法中的应用。未来的研究需要整合时序采样、多组学分析和多种生物模型，以全面阐明昼夜时钟失调如何通过影响EVs参与疾病进程。