删除hslV基因通过调节lon和T3SS-1蛋白，降低了鼠伤寒沙门氏菌在宿主体内的毒力和致死性

《Virulence》：Deletion of the hslV gene alleviates the virulence and lethality of Salmonella Typhimurium in hosts by modulating lon and T3SS-1

沙门氏菌HslV通过调控Lon表达影响T3SS-1效应蛋白和 flagella合成，从而增强入侵、生物膜形成及致病性，并在小鼠模型中显著降低存活率，为新型治疗靶点提供依据。

　　在食品传播的病原体中，沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）是一种极具威胁性的细菌。它通过旗袍介导的生物膜形成和III型分泌系统（T3SS）启动感染过程，这些机制对其致病性和抗生素耐药性起着关键作用。尽管其对公共健康构成了严重威胁，但目前尚缺乏能同时靶向T3SS效应物和生物膜形成的高效治疗策略。本研究通过删除hslV基因，构建了ΔhslV突变株，并发现该突变株在宿主细胞中的附着、入侵和胞内增殖能力显著下降。通过基因互补实验，这些缺陷得以恢复。动物实验进一步揭示了ΔhslV突变株在体内传播能力减弱，导致死亡率延迟。这些结果表明，HslV在促进沙门氏菌致病性方面具有重要作用。蛋白质组学分析结合SDS-PAGE和Western blot结果显示，ΔhslV突变株中T3SS-1效应物（如SipA、SipC）和鞭毛蛋白FliC的表达量下降，而Lon蛋白的表达量上升。值得注意的是，ΔhslV突变株中鞭毛蛋白表达量的减少可能与运动性和生物膜形成有关。机制上，HslV通过抑制Lon的表达来增强T3SS-1毒力因子的转录。功能上，它通过促进鞭毛组装和合成来增强趋化性，同时增强对宿主细胞的附着、入侵和生物膜形成能力。因此，HslV能够加剧感染、炎症反应和宿主死亡率。综上所述，本研究首次提供了HslV在沙门氏菌致病性调节中的关键证据，将其识别为一种对抗感染和抗生素耐药性的潜在治疗靶点。

沙门氏菌是一种常见的食源性病原体，对人类和动物均具有感染能力。它引起的疾病，如沙门氏菌病，是全球范围内重要的肠道感染之一。尽管这种疾病通常具有自限性，但在某些情况下可能进展为败血症和系统性感染，影响约2亿人，并导致每年超过20万例死亡。沙门氏菌的致病性与其两种不同的III型分泌系统（T3SSs）密切相关，这些系统分别编码于SPI-1和SPI-2两个致病性岛中。T3SS-1通过将毒性蛋白（效应物）注入宿主细胞，使细菌能够侵入宿主细胞，诱导肌动蛋白细胞骨架的皱褶和聚合/重塑，从而增强细菌对非吞噬细胞的摄入能力。T3SS-2则帮助沙门氏菌在上皮细胞间移动，并在巨噬细胞内复制和生存。研究表明，沙门氏菌的毒力不仅依赖于这些分泌系统，还与其鞭毛结构密切相关。鞭毛不仅有助于细菌的运动行为，如近表面游泳和扩散，还参与细菌的附着、生物膜形成和与宿主免疫系统的相互作用。因此，这些毒力因子的识别和调控在感染过程中起着重要作用，也促使宿主进化出多种策略来逃避或调节这些因子的识别。

面对不利的环境刺激，沙门氏菌对多种抗菌药物表现出日益增强的耐药性。生物膜形成是其抗生素耐药性的关键因素之一，相较于游离状态，生物膜形成的细菌对抗生素的抵抗力可高达1000倍。生物膜不仅帮助沙门氏菌在慢性感染期间附着于肠道，还显著增强了其在宿主体内的生存能力。根据美国国立卫生研究院的数据，80%的人类感染与生物膜有关。由生物膜引起的感染需要更复杂的抗生素组合治疗，而抗生素耐药性甚至可能导致每年1000万例死亡。因此，了解生物膜形成和相关毒力因子的调控机制对于开发新的治疗策略至关重要。

HslV，也被称为热休克蛋白基因位点V，是HslUV蛋白酶复合体的核心组分。HslV是一种蛋白酶，可以缓慢降解一些疏水性肽段和错误折叠的蛋白质。其活性在与HslU结合后可以显著增强。尽管已有大量研究阐明了HslV的结构及其在蛋白质折叠、运输和降解中的功能，但对其具体作用机制仍不完全清楚。蛋白质组学研究显示，HslV及其相关毒力因子在沙门氏菌侵入宿主细胞后表达水平显著上升。这些研究结果表明，HslV可能在自然感染条件下参与沙门氏菌的毒力调控。此外，热休克蛋白可能影响沙门氏菌的鞭毛运动、生物膜形成、细胞附着和炎症诱导能力。因此，HslV可能在生物膜形成和T3SS-1毒力基因表达中发挥重要作用。

为了深入了解HslV在沙门氏菌致病性中的生理和病理作用，我们利用细胞和小鼠感染模型研究了其在感染过程中的角色，并通过基于质谱的比较蛋白质组学分析了ΔhslV突变株与其亲本野生型株的蛋白质组差异。我们观察到ΔhslV突变株中某些T3SS-1效应物和Lon蛋白的表达水平显著变化。具体而言，HslV能够通过抑制Lon的表达来间接增强毒力基因的表达。值得注意的是，ΔhslV突变株在运动性、增殖能力和生物膜形成方面均受到显著抑制，从而减轻了沙门氏菌在小鼠体内的炎症和致死效应。我们的研究结果表明，HslV可能通过与Lon的相互作用来调控T3SS-1毒力基因的活性，为治疗干预和对抗沙门氏菌感染提供了新的靶点。

为了验证HslV在沙门氏菌感染过程中的作用，我们构建了ΔhslV突变株和互补株（ΔhslV+pHslV），并对其在宿主细胞中的附着、入侵和增殖能力进行了评估。首先，我们通过Western blot验证了野生型（WT）、ΔhslV和ΔhslV+pHslV株中HslV的表达水平。通过SRM技术结合LC-MS/MS分析，我们进一步量化了HslV的相对丰度。此外，这些菌株的生长模式相似，表明HslV基因的敲除或互补并未显著影响其在体外的生长能力。结果显示，ΔhslV突变株在附着能力上显著受损，而其在入侵和增殖能力上也表现出缺陷。竞争指数（CI）实验进一步显示，ΔhslV突变株在入侵宿主细胞和巨噬细胞方面的能力明显下降。相比之下，ΔhslV+pHslV突变株的入侵能力恢复至野生型水平。这些结果表明，HslV在沙门氏菌的入侵和增殖过程中起着关键作用。

在进一步探究HslV在沙门氏菌毒力中的作用时，我们通过感染C57BL/6J小鼠，比较了野生型和ΔhslV突变株在小鼠组织中的细菌负荷。CI实验显示，ΔhslV突变株在肝脏、脾脏和小肠中的竞争入侵能力显著下降，而ΔhslV+pHslV突变株的竞争入侵能力与野生型相似。此外，感染后6天，ΔhslV突变株的小鼠存活率明显高于野生型株，且体重减轻程度较轻。这些结果表明，HslV的缺失显著降低了沙门氏菌的致病能力。同时，ΔhslV突变株在感染小鼠的肝脏、肾脏、脾脏、小肠和结肠中的细菌负荷均低于野生型株。免疫荧光成像进一步支持了这一发现，显示ΔhslV突变株在小肠组织中的入侵能力显著降低。H&E染色和组织病理学分析还显示，ΔhslV突变株感染的小鼠在小肠中未出现显著的肠缩短或增强的炎症反应，这一现象在肝脏和脾脏中也得到一致观察。RNA测序结果显示，ΔhslV突变株感染的小鼠小肠中，淋巴细胞介导的免疫相关基因显著下调，这表明ΔhslV突变株未能有效引发小鼠肠道炎症反应。

为了进一步揭示HslV在沙门氏菌致病性中的作用，我们进行了全面的蛋白质组学分析。通过LC-MS/MS技术，我们鉴定了三种生物重复中的1058种蛋白质。其中，24种蛋白质在ΔhslV突变株中显著上调，而59种蛋白质则显著下调。这些变化主要集中在T3SS-1效应物（如SipA、SopB、SipC）和鞭毛蛋白（如FliA、FliC）的表达水平上。同时，Lon蛋白的表达水平显著增加。KEGG通路分析显示，这些差异表达蛋白（DEPs）主要富集于沙门氏菌感染通路及其他与细菌致病性相关的通路。我们通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络进一步分析了这些蛋白之间的关系，发现Lon和HslV在蛋白质折叠过程中可能具有协同作用。这些结果表明，HslV可能通过调控Lon的表达来影响T3SS-1效应物的表达，从而增强沙门氏菌的致病性。

通过研究HslV在沙门氏菌运动性和生物膜形成中的作用，我们发现ΔhslV突变株在运动性和生物膜形成方面均表现出显著缺陷。我们通过比较WT、ΔhslV和ΔhslV+pHslV菌株的游泳和扩散运动能力，发现ΔhslV突变株的运动区域明显小于野生型株。通过电子显微镜观察，我们发现ΔhslV突变株的鞭毛数量显著减少，这可能解释了其运动性下降的原因。此外，鞭毛运动对于沙门氏菌生物膜的形成至关重要，我们进一步测量了生物膜形成能力，发现ΔhslV突变株在24小时和48小时后形成的生物膜显著少于野生型株，而Δlon突变株则表现出相反的表型。这些结果表明，HslV可能通过调控Lon的表达来影响鞭毛运动和生物膜形成，从而增强沙门氏菌的致病性。

通过RT-qPCR分析，我们发现ΔhslV突变株中Lon的相对mRNA表达水平显著高于野生型株，而Δlon突变株中HslV的表达水平则与野生型相似。这表明HslV可能通过抑制Lon的表达来增强T3SS-1效应物的表达，从而促进沙门氏菌的致病性。进一步分析显示，ΔhslV突变株中T3SS-1效应物（如sipA、sopB、sipC）的mRNA水平显著低于野生型株，而Δlon突变株中这些效应物的mRNA水平则显著高于ΔhslV突变株。这表明HslV可能通过调控Lon的表达来间接促进毒力因子的表达。在小鼠模型中，Δlon突变株的细菌负荷显著高于野生型株，这可能与其在感染过程中对宿主免疫反应的调节有关。然而，目前尚不清楚HslV是否通过Lon直接调控毒力因子的表达，还是通过其他机制间接发挥作用。

生物膜对于微生物的生存和抗宿主防御机制至关重要。研究表明，鞭毛运动（如FliC）与生物膜形成能力呈负相关，影响沙门氏菌在宿主细胞表面的运动行为。生物膜形成不仅帮助沙门氏菌在宿主体内和体外建立长期定植，还显著增强了其生存能力。我们的研究结果表明，ΔhslV突变株在自然条件下形成生物膜的能力显著下降，且在动物器官中的定植能力也较野生型株弱。尽管有研究指出HslV可能参与细菌运动性和生物膜形成，但我们的研究发现ΔhslV突变株在与Vibrio Cholerae（霍乱弧菌）比较时，未表现出生物膜形成的显著差异。我们推测这可能与HslV在不同细菌中的氨基酸组成和功能差异有关。由于生物膜形成的增强会增加抗菌药物耐药性的风险，我们假设HslV的缺失可能有助于减少生物膜形成，从而减轻沙门氏菌的致死效应和耐药性。

综上所述，我们的研究数据表明，HslV是调控沙门氏菌毒力的关键因素。然而，本研究仍存在一些局限性：首先，尽管HslV在细胞和小鼠感染模型中被证实与上皮细胞通路中的附着和入侵有关，但其具体的调控机制仍需进一步探索。其次，虽然已有大量研究对Lon和Δlon突变株进行了表征，但本研究未系统比较Δlon、ΔhslV和ΔhslVΔlon突变株在附着、运动、生物膜形成和异常蛋白降解中的作用。这些比较将有助于更清晰地阐明HslV与Lon之间的调控关系。第三，HslV如何抑制Lon基因的表达尚不清楚，未来研究可以采用染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）和酵母双杂交实验等技术来进一步探索HslV-Lon调控网络。最后，尽管HslV在病原体的胞内蛋白降解和毒力中起重要作用，且因其在人类细胞中不存在而成为抗感染药物的潜在靶点，但针对HslV的药物开发仍面临挑战。即使被削弱的HslV突变株仍保留其蛋白降解活性，因此对HslV蛋白酶的药理学靶向需要更深入的研究。总的来说，我们的研究结果揭示了HslV-Lon调控轴在沙门氏菌致病性中的作用，为开发新的治疗策略提供了理论依据。