综述：脂肪干细胞来源的细胞外囊泡在伤口愈合中的应用

《International Journal of Nanomedicine》：Wound Healing: Harnessing Extracellular Vesicles Derived from Adipose-Derived Stem Cells

本综述系统阐述了慢性伤口治疗的临床挑战及脂肪干细胞（ADSCs）及其细胞外囊泡（ADSC-EVs）作为新兴治疗策略的巨大潜力。文章重点总结了ADSC-EVs通过其携带的丰富生物活性分子（如非编码RNA和蛋白质），精准调控伤口微环境中关键细胞（如巨噬细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、内皮细胞），从而促进再上皮化、血管生成、缓解炎症及抑制病理性瘢痕形成的多重机制。同时，综述还探讨了通过预处理策略和功能化递送材料增强ADSC-EVs疗效的途径，并展望了其临床转化的挑战与前景。

　　

摘要

慢性伤口是一项重大的临床挑战，给患者带来沉重负担，凸显了对更有效治疗方法的需求。在新兴策略中，脂肪干细胞（ADSCs）及其细胞外囊泡（ADSC-EVs）因其强大的伤口愈合能力而显示出巨大前景。临床证据表明，ADSC移植能有效促进多种慢性伤口的愈合，提高愈合质量，同时减少病理性瘢痕形成。作为ADSCs关键的旁分泌介质，ADSC-EVs因其在治疗开发和修复功能方面的优势而受到广泛关注。ADSC-EVs精确调控伤口微环境中的关键细胞，包括角质形成细胞、巨噬细胞、内皮细胞和成纤维细胞。这种调控促进了再上皮化、缓解了炎症、刺激了血管生成，并调节了细胞外基质重塑。这些调节效应归因于ADSC-EVs携带的丰富生物活性分子，包括蛋白质和非编码RNA。值得注意的是，预处理策略和功能性递送材料可以通过富集特定的治疗分子和实现可控释放，进一步增强ADSC-EVs的调节作用。此外，ADSC-EVs可作为外源性治疗药物的高效递送载体，产生协同效应。总之，ADSCs和ADSC-EVs在慢性伤口管理方面都展现出巨大的临床潜力。

引言

慢性伤口是指无法在预期时间内愈合且愈合过程受损的损伤。这种损伤主要表现为持续的炎症、再生能力降低和组织重塑受损。常见的潜在病因包括静脉功能不全、糖尿病神经病变、压力性损伤和动脉功能不全。作为一种重大的全球健康负担，慢性伤口影响了约1%–2%的人口。此外，它们影响高达5%的成年人，并占医疗保健支出的10%。近期研究表明，在5年期间，慢性伤口患者数量增加了71%，而相应的护理成本增加了48%。

慢性伤口的临床管理策略因伤口类型而异。清创是基础方法，通过清除坏死组织、感染物质和异物来减少炎症并暴露健康组织。后续步骤包括感染控制、维持湿润的伤口愈合环境、确保充足的营养和管理基础疾病。此外，管理还涉及减压、负压伤口治疗、改善组织灌注和氧合，以及使用生物制剂作为辅助疗法。然而，目前的治疗选择仍然非常有限。大多数方法侧重于症状管理，而非纠正功能失调的伤口微环境，这阻碍了正常愈合机制的恢复。延长的治疗周期和高昂的医疗成本进一步加剧了患者和医疗系统的负担。因此，开发能够从根本上促进生理性伤口愈合的创新疗法是现代临床实践中的一项紧迫挑战。

近年来，间充质干细胞（MSCs）及其细胞外囊泡（EVs）已成为伤口修复领域的关键生物治疗剂。MSCs通过其分化为皮肤细胞谱系（如成纤维细胞和角质形成细胞）的能力以及旁分泌信号来促进伤口愈合。值得注意的是，研究表明只有一小部分移植的MSCs在伤口部位实际分化，强调了旁分泌机制在驱动其治疗效果中的关键作用。作为关键的旁分泌介质，MSCs分泌的EVs（MSC-EVs）通过多种机制发挥促修复功能，包括免疫调节、血管生成激活、上皮再生加速和纤维化抑制，从而提升愈合质量。

在各种MSCs和MSC-EVs来源中，脂肪干细胞（ADSCs）及其EVs（ADSC-EVs）由于其可及性、高丰度以及已证实的促进伤口愈合的功效，近年来受到了广泛关注。本综述全面概述了ADSCs在伤口修复中的应用，特别关注ADSC-EVs作为一种创新的无细胞策略以加速愈合过程。ADSC-EVs的核心治疗机制包括调节免疫微环境、增强组织再生和抑制病理性瘢痕形成。通过综合现有证据，本综述旨在为推进基于ADSC-EVs的疗法临床转化奠定理论基础。

ADSCs在伤口愈合中的作用机制

大量实验证据已证实ADSCs在加速伤口修复方面的治疗潜力。ADSCs可以直接分化为皮肤细胞以支持组织再生。它们表现出显著的可塑性，在特定的微环境 cues 下分化为成纤维细胞、角质形成细胞、上皮细胞和内皮细胞。例如，Altman等人证明，将ADSCs与脱细胞真皮基质共同移植到全层皮肤缺损中，ADSCs分化为血管内皮细胞（表达von Willebrand因子和平滑肌肌动蛋白SMA）和成纤维细胞（热休克蛋白47 HSP47阳性），从而显著增强新组织形成。这种分化能力使ADSCs成为结构和功能伤口修复的自我更新细胞库。除了分化潜能，ADSCs还通过其调节作用促进伤口愈合。Cui等人报道，ADSC移植促进M2巨噬细胞极化，从而减轻慢性炎症并减少纤维化。ADSCs的调节作用很大程度上归因于其旁分泌机制。例如，Cerqueira等人发现ADSCs上调角质形成细胞生长因子（KGF）表达，刺激角质形成细胞增殖并调节表皮结构和形态。此外，Nie等人报道ADSCs分泌血管生成细胞因子，包括血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）和成纤维细胞生长因子2（FGF2），从而促进伤口愈合。

有前景的临床前结果推动了ADSCs在伤口管理中的临床转化，多项注册试验正在评估其治疗效果。如表1总结，对PubMed数据库的系统检索确定了16项已发表的评估ADSCs用于皮肤伤口愈合的临床试验。纳入的研究涵盖了四种不同的疾病模型：慢性溃疡（n = 4）、糖尿病伤口（n = 5）、术后瘢痕预防（n = 3）和瘢痕修复（n = 4，3例痤疮瘢痕和1例成熟小儿烧伤瘢痕）。关于细胞来源，研究使用了处理过的脂肪组织（例如，通过离心或微片段）、基质血管组分（SVF）或ADSCs。除两项试验使用同种异体材料外，所有干预措施均为自体。局部注射是主要的给药途径（14/16研究），而两项试验使用掺入水凝胶或凝胶基载体的同种异体ADSCs进行局部应用。大多数试验是探索性先导研究；只有两项是II期临床试验，尚未有III期研究报道。样本量通常较小：除两项研究分别纳入100和114名参与者外，所有其余试验均少于100名受试者，符合初步安全性和有效性评估。随访时间从3到12个月不等，遵循标准的伤口愈合研究方案。尽管大多数研究报告了高随访依从性，但两项试验的退出率超过20%。十二项试验采用随机对照设计；然而，由于技术限制，很少实施双盲（3/16）。使用Cochrane RoB 2.0工具进行的偏倚风险评估显示，16项研究中有14项存在高偏倚风险。未报告与治疗相关的严重不良事件。十四项试验得出结论，基于ADSC的疗法增强了伤口愈合，减轻了瘢痕形成或改善了现有瘢痕，而两项研究发现相对于对照组没有显著益处。在两项低偏倚试验中，一项证明自体SVF凝胶显著减少了乳房成形术后的瘢痕形成，而另一项报道自体脂肪移植后成熟小儿烧伤瘢痕没有显著改善。总之，目前的临床证据支持基于ADSC的干预措施用于慢性伤口愈合和瘢痕调节的安全性和治疗潜力。同种异体ADSC移植也显示出相当的安全性和有效性，从而拓宽了临床适用性。然而，鉴于主要存在高偏倚风险以及低偏倚研究的有限样本量（n = 16和n = 9），需要进行大规模、严格设计的双盲随机对照试验，以明确确立基于ADSC的疗法在伤口愈合中的有效性和安全性。

MSC-EVs作为无细胞治疗剂

EVs是几乎所有细胞类型普遍释放的脂质双分子层囊泡。根据生物发生途径分类的三种主要EV亚型包括外泌体、微囊泡和凋亡小体（图1）。外泌体的生物发生涉及三个不同的阶段。最初，质膜内陷形成早期内体。这些早期内体然后通过内体膜向内出芽成熟为包含腔内囊泡（ILVs）的多囊体（MVBs）。最后，ILVs通过MVB与质膜融合作为外泌体释放。相比之下，微囊泡直接起源于质膜的外向出芽，而凋亡小体是在凋亡细胞碎片化过程中产生的。在这三种EVs中，外泌体得到了最广泛的研究。然而，当前的分离方案通常产生外泌体和小微囊泡（尺寸 < 200 nm）的异质混合物。在本研究中，我们使用术语“EVs”特指这些混合群体。“MVs”表示较大的微囊泡，根据引用的文献，通过13,000 x g的离心沉淀。“ApoBDs”指凋亡小体，基于参考文献，由细胞在staurosporine诱导的凋亡后产生。

EVs由脂质、蛋白质和核酸组成（图1）。MSC-EVs表达多种特征性蛋白质，包括ALG-2相互作用蛋白X（Alix）、膜转运蛋白（annexin和Rab GTPase）、四跨膜蛋白（CD63、CD9和CD81）、主要组织相容性复合物I/II（MHC I/II）和热休克蛋白（HSP70）。此外，它们携带从供体细胞继承的多种生物活性分子，如生长因子、酶和RNA。这些生物活性分子可以通过MSC-EVs的摄取递送到伤口床内的受体细胞，从而改善再上皮化、促进血管生成和抑制炎症。

鉴于MSC-EVs表现出与MSCs相当的调节功能，它们越来越被认为是MSC-based疗法的一种有前景的无细胞替代品。表2详细比较了MSC-EVs在治疗开发中相对于MSCs的优势。MSC-EVs的优越特性，包括易于鉴定、高稳定性、方便的储存和运输、成本效益、临床给药途径的灵活性、跨越生物屏障的能力和可被工程化用于靶向递送，以及副作用风险最小，使它们比MSCs更容易转化为临床应用。

ADSC-EVs在伤口愈合中的作用

伤口愈合是一个动态协调的生理过程，由组织损伤启动，并经历四个相互依赖的阶段：止血、炎症、增殖和重塑。慢性或糖尿病伤口常常停滞在炎症阶段，导致愈合受损。ADSC-EVs已成为这一复杂过程的主要调节者，主动调节伤口环境中的细胞行为（图2）。通过将生物活性 cargo 递送至角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞，ADSC-EVs加速再上皮化、诱导血管生成、解决病理性炎症并减轻异常纤维化。这种多方面的干预策略使ADSC-EVs成为治疗顽固性伤口的高度有前景的治疗平台。

ADSC-EVs调节免疫微环境

炎症在伤口愈合中发挥双重作用，以动态方式精细调节。在伤口形成的早期阶段，良好平衡的炎症反应对于有效清除病原体和坏死组织至关重要，从而为组织修复建立无菌环境。然而，随着愈合过程的进展，炎症的及时消退成为启动组织再生和重塑的关键节点。在糖尿病等病理条件下，炎症反应异常延长，产生持续的促炎状态，最终阻碍修复过程。在此背景下，核心免疫效应细胞（尤其是中性粒细胞和巨噬细胞）的功能障碍成为慢性伤口愈合受损的核心细胞机制。近期研究表明，ADSC-EVs能够通过调节这些免疫细胞来重塑伤口炎症微环境，从而克服愈合停滞状态。

巨噬细胞是伤口修复的核心协调者，其动态表型转换（M1→M2）精确协调愈合的进展。在早期阶段，M1巨噬细胞分泌促炎细胞因子，强力清除病原体和细胞碎片。在后期阶段，M2巨噬细胞释放抗炎细胞因子，驱动血管生成和胶原重塑。慢性伤口的核心缺陷在于巨噬细胞保留在M1表型，这阻止了炎症的消退并阻断了修复信号的传递。ADSC-EVs可以通过巨噬细胞调节逆转这种失衡。例如，Yin等人发现ADSC-EVs通过其 cargo circRps5 促进M2巨噬细胞极化，circRps5 调节 miR-124-5p。类似地，Li等人证明ADSC-EVs携带的长链非编码RNA（lncRNA）H19通过调节miR-130b-3p促进M2极化。除了改变极化，ADSC-EVs还调节巨噬细胞释放促修复因子。Wang等人发现ADSC-EVs促进巨噬细胞释放白细胞介素-33（IL-33），从而调节M2极化并增强伤口修复。Hsu等人报道ADSC-EVs诱导单核细胞/巨噬细胞分泌转化生长因子-β1（TGF-β1），激活TGF-β/Smad3信号通路以促进愈合。低氧预处理是提高MSC-EV产量和疗效的常用策略。低氧诱导的ADSC-EVs递送circ-Snhg11来调节miR-144-3p/缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）信号轴，促进M2极化。此外，ADSC-EVs作为活性因子的递送载体，通过携带的蛋白质或核酸调节巨噬细胞以促进修复。例如，Su等人通过在ADSCs中过表达miR-21-5p产生了富含miR-21-5p的ADSC-EVs；这些EVs有效促进了伤口愈合，降低了炎性细胞因子表达，并增强了M2极化。Yu等人通过使用过表达胸腺素β4（Tβ4）的ADSCs产生负载Tβ4的ADSC-EVs，显著增强了M2极化并加速了伤口愈合，从而抑制了炎症。

中性粒细胞是伤口的第一反应者，通过释放抗菌肽和形成中性粒细胞胞外陷阱（NETs）来控制感染。在生理性愈合中，中性粒细胞在完成任务后应及时发生凋亡并被巨噬细胞清除。然而，在糖尿病伤口中，中性粒细胞凋亡延迟和NETs过度释放导致清除受损。ADSC-EV治疗可以减少伤口部位的中性粒细胞数量，从而促进糖尿病伤口愈合。除了巨噬细胞和中性粒细胞，其他免疫细胞也有助于愈合网络。例如，增加的肥大细胞脱颗粒与糖尿病伤口愈合受损相关。给予ADSC-EVs可能减少糖尿病伤口部位脱颗粒的3型肥大细胞的比例，从而加速愈合过程。

ADSC-EVs促进组织再生

增殖期是伤口愈合的关键阶段，包含关键的生理过程，包括肉芽组织形成、再上皮化、新生血管形成、胶原沉积和伤口收缩。该阶段需要多种细胞类型的协调行动，如成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞。然而，在慢性伤口中，持续的炎症或缺氧严重损害细胞功能，破坏增殖期。ADSC-EVs在病理条件下促进这些细胞的增殖、迁移和功能恢复，从而加速伤口愈合并促进难愈性伤口的解决。

成纤维细胞作为伤口愈合的关键参与者，在炎症消退过渡期间被募集到伤口部位。它们分泌基质金属蛋白酶（MMPs）以降解纤维蛋白凝块，并产生细胞外基质（ECM）成分以替代临时基质。由此产生的ECM不仅支持成纤维细胞的迁移和活性，还为血管生成、肉芽组织形成和上皮化提供了结构和信号基础。ADSC-EVs已成为成纤维细胞功能的有效调节者，通过多种机制促进伤口愈合。2016年，Hu等人首次报道ADSC-EVs可以通过促进成纤维细胞增殖和迁移，并上调多种基因（包括I型和III型胶原、神经钙粘蛋白、增殖细胞核抗原PCNA和细胞周期蛋白D1）的表达来优化成纤维细胞特性，从而加速伤口愈合。2021年，Wang等人证明ADSC-EVs可以通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号通路增强人成纤维细胞的增殖和迁移并促进胶原沉积。鉴于慢性伤口中存在炎症刺激和缺氧，ADSC-EVs在这些条件下对成纤维细胞的调节作用也得到了探索。Heo等人报道ADSC-EVs能够抑制由干扰素γ（IFNγ）和肿瘤坏死因子α（TNFα）刺激的成纤维细胞的炎症反应。Patel等人进一步证明ADSC-EVs通过转运lncRNA GAS5和调节Toll样受体7（TLR7）来抵消过氧化氢和脂多糖对成纤维细胞的不利影响。

角质形成细胞是表皮中的主要细胞，在伤口愈合中起关键作用。受伤后，它们通过协调的细胞迁移、增殖和分化重新建立上皮屏障。此外，角质形成细胞分泌多种因子，促进再上皮化、刺激血管生成和增强结缔组织基质的产生。积累的证据表明ADSC-EVs可以促进角质形成细胞的增殖和迁移。例如，Zhang等人证明ADSC-EVs通过激活AKT/HIF-1α信号通路增强HaCaT细胞迁移。类似地，Lv等人发现ADSC-EVs通过Wnt/β-catenin信号通路促进HaCaT细胞增殖和迁移。值得注意的是，在ADSC-EVs中过表达miR-21-5p进一步增强了这种调节作用。除了这些发现，ADSC-EVs已被证明可以增强角质形成细胞的调节能力。Ren等人报道ADSC来源的MVs上调HaCaT细胞中VEGF-A、血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、α-SMA和纤连蛋白的表达，从而通过增强血管生成和再上皮化加速伤口愈合。与成纤维细胞类似，慢性伤口中的角质形成细胞常常遭受炎症和缺氧，这可能损害其功能。ADSC-EVs在这些条件下对角质形成细胞的影响也得到了研究。Ma等人观察到过氧化氢抑制HaCaT细胞增殖和迁移，同时促进凋亡。然而，用ADSC-EVs治疗有效逆转了这种有害影响。He等人进一步证明ADSC-EVs通过将MALAT1转运至靶点miR-124并激活Wnt/β-catenin信号通路，来抵消过氧化氢对HaCaT细胞增殖和迁移的抑制作用。

伤口部位的微血管系统提供必需的营养和氧气，支持细胞增殖和分化，从而促进伤口愈合。然而，在不愈合的伤口中，如与糖尿病和某些慢性病相关的伤口，血管生成严重受损。内皮细胞在驱动血管生成中起关键作用。积累的证据表明ADSC-EVs可以修饰内皮细胞，增强其在伤口愈合过程中的增殖、迁移和管形成能力。例如，Sun等人报道ADSC-EVs显著促进人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的增殖、迁移和管形成。进一步的机制研究表明，ADSC-EVs中EGR-1表达升高通过上调HUVECs中的lncRNA-SENCR激活角蛋白假尿苷合酶1（DKC1）/VEGF-A轴，从而增强血管生成并促进伤口愈合。Heo等人证明ADSC-EVs可以通过转运miR-132和miR-146a促进HUVECs的增殖和管形成，并上调多种促血管生成基因。在糖尿病伤口中，内皮细胞受到高葡萄糖水平和氧化应激的损害。高葡萄糖条件会损害HUVEC迁移和管形成，并下调血管生成基因。用ADSC-EVs治疗可以通过减少活性氧（ROS）产生和通过sirtuin 3（SIRT3）/超氧化物歧化酶2（SOD2）通路保护线粒体功能来逆转这些损伤。过氧化氢诱导的氧化应激可触发HUVEC凋亡并消除其迁移能力。从MMP可降解的聚乙二醇（PEG）水凝胶释放的ADSC-EVs可以显著减轻过氧化氢诱导的HUVECs氧化应激，从而促进糖尿病伤口愈合。

ADSC-EVs预防瘢痕形成

在伤口愈合过程中，过度的成纤维细胞增殖和功能障碍，结合无序的胶原沉积，常常导致肥厚性瘢痕和瘢痕疙瘩。这些病理性瘢痕引起不良影响，包括疼痛、瘙痒和美观问题，严重损害患者的心理健康和生活质量。

ADSC-EVs通过调节成纤维细胞来减轻瘢痕形成。Hu等人证明ADSC-EVs优化成纤维细胞功能，在早期愈合增强I/III型胶原合成，同时在后期抑制胶原表达以最小化瘢痕形成。随后，同一组报道ADSC-EVs通过增加III型与I型胶原的比例促进ECM重塑，进一步减少瘢痕形成。Chen等人表明ADSC-EVs下调miR-181a以激活肥厚性瘢痕成纤维细胞中的SIRT1，减少胶原和α-SMA表达。体内研究证实ADSC-EVs减少小鼠伤口中的胶原沉积，并显示出优于无EVs的ADSC分泌组的抗瘢痕形成效果，包括减弱的胶原积累和肌成纤维细胞聚集。

MicroRNAs是ADSC-EVs效应的关键介质。Li等人鉴定出ADSC-EVs中的miR-192-5p作为成纤维细胞中IL