Kp03重组酶介导的千碱基级DNA片段在植物细胞中的高效定点整合技术研究

《Cell Reports》：Efficient site-specific integration of kilobase-length DNA fragments in plant cells via Kp03 recombinase

本研究针对植物基因组大片段DNA定点整合效率低的技术瓶颈，系统评估了大型丝氨酸重组酶Kp03在植物系统中的性能。研究表明，Kp03可高效介导长达27.3 kb的DNA片段在水稻和拟南芥原生质体中的定点整合，且仅需15-bp的最小attB识别序列。通过结合NM-PE基因组编辑系统在水稻愈伤组织中成功实现3.4-kb供体DNA的靶向整合，为植物合成生物学提供了强大工具。

　　

在植物遗传改良和合成生物学领域，如何将大片段外源DNA精准、高效地插入特定位点一直是技术瓶颈。传统的CRISPR-Cas9技术依赖双链断裂（DSBs）诱导的DNA修复途径，但常伴随插入缺失突变、染色体碎裂等副作用。虽然PrimeRoot编辑系统可实现11.1 kb片段的靶向插入，但其容量仍有限制。大型丝氨酸重组酶（LSRs）因其高特异性和不依赖宿主修复机制的特性，为这一难题提供了新思路。

福建农林大学和天津大学的研究团队在《Cell Reports》上发表了关于Kp03重组酶在植物基因组工程中应用的重要研究成果。该研究系统评估了Kp03在植物细胞中介导大片段DNA定点整合的能力，发现其可高效整合长达27.3 kb的DNA片段，并确定了仅需15-bp的最小attB识别序列即可实现靶向整合。

研究采用原生质体瞬时表达、qPCR定量分析、粒子轰击转化等关键技术方法，样本包括水稻品种Kitaake和拟南芥Col-0。通过构建包含Kp03表达载体、attP供体质粒和attB靶标质粒的三组分系统，在原生质体中评估重组效率；利用NM-PE系统在水稻TOR基因位点安装26-bp attB序列，验证Kp03在愈伤组织中的整合能力。

Kp03 exhibits high recombination activity in plant cells

研究人员首先设计了质粒重组实验系统：包含Kp03-GFP表达质粒、带有attP识别位点和无启动子mCherry基因的attP质粒，以及带有attB识别位点和组成型启动子的attB质粒。实验结果表明，只有当三种质粒共转染时，水稻和拟南芥原生质体中才能检测到强烈的mCherry荧光信号，且这些信号仅出现在表达Kp03-GFP的细胞中。定量分析显示，Kp03在两种植物细胞中都表现出极高的质粒重组活性，效率分别达到99.1%（水稻）和94.4%（拟南芥）。

Kp03 recombination efficiencies negatively correlate with donor size

为评估Kp03整合大片段DNA的能力，研究团队构建了不同大小（9.9 kb、17.4 kb和27.3 kb）的attP供体质粒。通过建立的qPCR检测方法发现，随着供体DNA尺寸的增加，重组效率呈下降趋势。对于9.9 kb的供体，水稻细胞中的整合效率仍保持在80.5%，而17.4 kb和27.3 kb的供体效率分别降至42.5%和8.2%。拟南芥中也观察到类似趋势，证明Kp03可有效介导多kb级DNA片段在植物细胞中的靶向插入。

Minimal attB sequences required for Kp03-mediated recombination

为简化基因组中着陆位点的安装，研究人员测试了不同长度（26 bp、21 bp、15 bp和13 bp）的attB序列对重组效率的影响。结果显示，26 bp和21 bp的attB序列仍能保持较高重组效率（水稻中分别为69.6%和48.3%），而15 bp的attB序列效率显著降低至2.3%，13 bp则完全无活性。这一发现表明，15 bp的最小attB序列是Kp03介导整合的必要条件，大大降低了通过基因组编辑工具安装着陆位点的难度。

Kp03 enables targeted genome integration in rice protoplasts

通过BLAST比对，研究人员在水稻基因组中发现了一个与15 bp最小attB序列完全匹配的位点（染色体2：5,539,656-5,539,670）。将Kp03-GFP和3.4 kb的attP供体质粒共转染水稻原生质体后，PCR扩增和测序证实了供体DNA在该基因组位点的成功整合，证明Kp03可在单次递送反应中实现植物基因组的大片段DNA直接插入。

Kp03 enables targeted genome integration in rice callus with engineered attB sites

为进一步验证Kp03在植物组织中的应用潜力，研究团队利用NM-PE系统在水稻TOR基因前插入26 bp的Kp03 attB位点，随后通过粒子轰击共递送Kp03-GFP和3.4 kb attP供体质粒。在37个独立的T0愈伤组织系中，有4个（10.8%）检测到了成功的整合事件，测序证实了在工程化基因组位点的准确整合，并成功再生了携带靶向重组事件的植株。

研究结论与讨论部分强调，Kp03作为植物基因组工程工具具有显著优势：其高效整合大片段DNA的能力（可达27.3 kb）超越了现有多数技术；仅需15 bp最小attB序列的特性简化了着陆位点的安装；与基因组编辑工具结合可实现稳定基因叠加和性状导入。尽管在原生质体中成功实现了基于内源性attB位点的直接整合，但在愈伤组织中的低效率提示需要进一步优化。未来通过定向进化或结构引导的突变可能获得对更短或简并attB序列具有更高活性的Kp03变体，扩展其在多种植物物种中的应用前景。

该研究的局限性包括大部分实验在瞬时原生质体体系中进行，可能无法完全反映完整植物组织中的重组效率；Kp03需要预安装attB位点，限制了其在无前期工程化位点的应用场景中的直接使用；随着载体尺寸增加效率下降，特别是超过17 kb时效率显著降低，提示需要对超大DNA构建体进行进一步优化。