人基底核类器官构建成功：功能性胆碱能投射为神经疾病研究提供新模型

《Cell Stem Cell》：Generation of human nucleus basalis organoids with functional nbM-cortical cholinergic projections in transplanted assembloids

本研究针对阿尔茨海默病和唐氏综合征等神经疾病中基底前脑Meynert核(nbM)胆碱能通路功能障碍的建模难题，开发了从人多能干细胞(hPSCs)分化生成人nbM类器官(hnbMOs)的新方法。研究人员通过优化Sonic hedgehog(SHH)信号通路和β-神经生长因子(β-NGF)组合，成功获得富含功能性胆碱能投射神经元(CHNs)的3D类器官，并构建了nbM-皮层组装体，证实其可形成功能性神经连接。该模型首次在移植小鼠体内重建了完整的人源胆碱能通路，并成功模拟了唐氏综合征中的投射缺陷，为研究神经退行性和神经发育障碍提供了重要平台。

　　

在人类大脑的复杂神经网络中，基底前脑的Meynert核(nucleus basalis of Meynert, nbM)扮演着至关重要的角色。这个富含胆碱能神经元(cholinergic neurons, CHNs)的核团通过长长的轴突投射到大脑皮层，释放乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)，动态调节皮层活动，在学习、记忆和认知功能中起着关键作用。然而，当这条nbM-皮层胆碱能通路出现功能障碍时，就会导致一系列严重的神经系统疾病，包括阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)和唐氏综合征(Down syndrome, DS)。

长期以来，科学家们缺乏能够准确模拟人类nbM及其胆碱能通路的研究模型。传统的二维细胞培养无法重现大脑的三维结构和细胞多样性，而动物模型则存在物种差异，不能完全模拟人类特异的病理特征。尽管脑类器官技术近年来取得了显著进展，能够生成多种脑区特异性类器官，但专门模拟nbM及其胆碱能投射的类器官模型尚未见报道。

在这一研究背景下，南京医科大学的研究团队在《Cell Stem Cell》上发表了他们的最新成果。他们开发了一种创新方法，成功从人多能干细胞(human pluripotent stem cells, hPSCs)中生成功能性人nbM类器官(human nbM organoids, hnbMOs)，这些类器官不仅包含具有典型投射神经元形态的CHNs，还能在体外和体内形成功能性nbM-皮层胆碱能连接。更令人振奋的是，研究人员还通过移植技术，首次在小鼠体内重建了完整的人源胆碱能通路，为研究相关神经系统疾病提供了强大的平台。

研究人员采用了几项关键技术开展本研究：通过优化SHH信号通路和β-NGF组合诱导hPSCs定向分化为hnbMOs；利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)验证类器官的细胞类型和区域特性；构建nbM-皮层组装体模型研究区域间相互作用；开发双移植技术在小鼠体内重建完整人源神经通路；应用光遗传学、膜片钳和钙成像等技术评估神经功能连接；使用逆行狂犬病毒追踪技术验证突触连接；并利用唐氏综合征患者来源的iPSCs建立疾病模型。

生成hnbMOs从hPSCs

研究人员首先建立了一个从hPSCs生成hnbMOs的分化方案。他们在神经上皮阶段(第10天)使用高浓度SHH(750 ng/mL)联合SHH通路激动剂purmorphamine(Pur)处理，促进内侧神经节隆起(medial ganglionic eminence, MGE)祖细胞的生成，这些细胞可发育成nbM。随后添加神经生长因子(nerve growth factor, NGF)以促进CHNs的进一步分化。

通过免疫荧光染色，研究人员证实hnbMOs在分化第63天表达前脑标志物FOXG1(92%±1.168%)和神经元标志物TUJ1，同时富含CHNs标志物CHAT(38.13%±1.62%)和乙酰胆碱转运蛋白(vesicular acetylcholine transporter, VACHT)(91.6%的CHAT+神经元表达)。单细胞RNA测序分析揭示了hnbMOs中包含6种细胞类型：分裂放射状胶质细胞(RG-div)、放射状胶质细胞(RGCs)、中间祖细胞(IPCs)、未成熟神经元(IMs)、GABA能神经元(GABAs)和CHNs。

转录组分析显示，hnbMOs与人类胎儿大脑nbM区域具有高度相似性，而与其他MGE衍生核团如内侧隔核(medial septum, MS)和Broca对角带(diagonal band of Broca, DBB)相似性较低。这些结果表明hnbMOs在转录水平上具有特定的MGE谱系特征和nbM身份。

hnbMOs的形态和功能成熟

为了评估hnbMOs的形态和功能成熟，研究人员构建了CHAT报告细胞系，将荧光蛋白tdTomato插入CHAT基因座(CHAT-tdT hPSCs)。结果显示，90%的mCherry+细胞为CHAT+ CHNs，这些细胞在分化第100天表现出典型的投射神经元形态，具有长神经突和树突棘。

电生理记录显示，hnbMOs在第63天表现出去极化诱发的钠电流和快速钾电流，以及诱发和自发的动作电位，证实了它们的电生理活动性。通过使用乙酰胆碱生物传感器(ACh3.0)，研究人员检测到KCl刺激后GFP信号强度显著增加，证明了hnbMOs中ACh的功能性释放。

钙成像和高密度三维微电极阵列(high-density 3D microelectrode array, HD-MEA)记录显示，hnbMOs在第80天和第120天分别表现出同步自发性钙活动和网络级同步化，表明其神经网络的成熟特性。

移植小鼠和共培养脑片中hnbMOs投射的特征

胆碱能投射神经元以长距离、高度分支的轴突树突投射到皮层为特征。为了研究hnbMOs中CHNs的投射特性，研究人员将hnbMOs移植到严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency, SCID)Beige小鼠的nbM区域。

移植后2个月的T2加权MRI显示，移植的类器官准确定位在宿主大脑的nbM区域。免疫荧光分析显示，移植的人类细胞表达CHAT(36.38%)、FOXG1(92.66%)、NKX2.1(78.25%)和OLIG2(21.73%)。移植后6个月，研究人员观察到从移植类器官到宿主皮层的长约3.5毫米的长距离投射束，这些投射主要分布在初级体感皮层(primary somatosensory cortex, S1)、初级运动皮层(primary motor cortex, M1)和基底外侧杏仁核(basolateral amygdala, BLA)，而尾壳核(caudate putamen, CPu)和海马体(hippocampus, HPC)中只有稀疏投射，丘脑(thalamus, TH)和下丘脑区域(hypothalamic region, HRH)中信号极少。

研究人员还发现，移植后CHNs从最初的巢状结构逐渐分散，形成更丰富的投射神经元，这一发育过程与人类胎儿大脑中MGE的发育相似。共聚焦显微镜分析显示，大量STEM121+纤维投射到小鼠皮层，与小鼠锥体神经元的过程紧密相邻，并表达人特异性突触素(synaptophysin, SYP)。

此外，研究人员将CHAT报告hnbMOs与妊娠15周(gestational weeks, GW15)的人胎儿脑片共培养，2周后观察到hnbMOs衍生的CHNs存活良好，延伸出长分支神经突，并向胎儿皮层投射丰富的GFP+纤维，距离超过2厘米。

体外生成nbM-皮层组装体

通过将hnbMOs与人皮层类器官(human cortical organoids, hCOs)融合，研究人员生成了nbM-皮层组装体。融合后，hCOs比hnbMOs扩张更快，这与人类大脑发育过程中皮层的快速扩张一致。

为了可视化投射，研究人员在融合前用AAV-hSYN-GFP标记hnbMOs。融合后20天，hCO和hnbMO保留了它们的区域标志物，约90%的GFP+细胞表达NKX2.1，超过40%表达CHAT。研究人员观察到丰富的GFP+ hnbMOs衍生投射束进入组装体的hCO区域，且这些投射随时间增加(从6.06%到22.51%)，但避免进入hCO的脑室区(ventricular zone, VZ)，这与正常生理一致。

通过使用狂犬病毒逆行标记技术，研究人员证实hnbMOs衍生的CHNs与hCOs形成突触连接，近60%的GFP和mCherry双阳性细胞为CHAT+ CHNs。免疫组织化学分析显示，从hnbMO到hCO的投射中存在突触前标志物SYP和突触后标志物PSD95的共定位。

功能上，通过光遗传学刺激hnbMOs，在hCO神经元中检测到平均振幅约40 pA的光诱发兴奋性突触后电流(optogenetically evoked excitatory postsynaptic currents, oEPSCs)和神经元放电，证明了hnbMO和hCO之间的突触连接。钙成像显示hnbMOs和hCOs之间存在同步钙活动，且这种活动可被乙酰胆碱受体拮抗剂scopolamine butylbromide抑制，表明皮层钙信号主要通过毒蕈碱受体受胆碱能输入调节。

移植组装体中nbM-皮层投射的构建

为了在体内重建人nbM-皮层通路，研究人员创新性地将相应的类器官移植到小鼠的皮层和nbM区域，创建移植组装体。移植后6个月，移植的mCherry+ hCOs和GFP+ hnbMOs均存活良好，且观察到广泛的hnbMOs衍生胆碱能投射进入hCOs。

整体上，CHNs在双移植小鼠中的投射偏好与先前描述的移植nbMOs中的投射模式高度相似。同时，移植的hCOs向宿主大脑的多个区域发出丰富投射，遵循体内皮层投射模式。值得注意的是，观察到mCherry+神经突束穿过并分离移植的hnbMOs。

功能上，移植前用光遗传学病毒载体预标记hnbMOs，移植后4个月，光刺激hnbMOs移植体可在mCherry标记的hCO神经元中诱发约20 pA的oEPSCs，表明移植的hnbMOs和hCOs之间形成了功能性突触。

DS中nbM-皮层通路胆碱能投射缺陷的建模

最后，研究人员探讨了nbM-皮层组装体是否能用于模拟与神经发育障碍相关的胆碱能投射缺陷。唐氏综合征是一种由21号染色体额外拷贝引起的遗传性疾病，与智力残疾相关。先前研究表明DS患者表现出淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)相关神经病理学和降低的ACh活性，表明异常的胆碱能连接可能是DS认知障碍的基础。

研究人员验证了中期妊娠胎儿大脑和小鼠大脑皮层中CHAT的表达，发现DS皮层中的CHAT表达显著低于对照，表明DS皮层中胆碱能神经元投射减少。为了研究DS中nbM-皮层投射缺陷是否能被模拟，研究人员将DS患者来源的hiPSCs分化为hnbMOs。

结果显示，DS hnbMOs中MGE祖细胞(NKX2.1)和CHNs(CHAT)的比例显著降低，且CHAT蛋白水平减少。通过生成DS来源和对照来源的nbM-皮层组装体，研究人员发现DS来源组装体中从hnbMO到hCO区域的GFP+神经纤维明显少于对照，表明投射缺陷。

单细胞RNA测序分析显示，DS hnbMOs中CHNs比例降低。基因本体(Gene Ontology, GO)分析显示，差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)在与轴突发生和轴突发育相关的通路中显著富集。在这些与轴突发育相关的DEGs中，ANK3和NCAM2被鉴定为与DS神经发育障碍相关。

通过狂犬病毒逆行追踪，研究人员观察到DS来源组装体中hnbMO侧GFP和mCherry双阳性细胞比例显著降低。活细胞钙成像显示，与对照相比，DS组装体中hnbMO和hCO之间的同步钙活动大幅减少，表明神经网络事件受损。

为了检测投射缺陷的起源，研究人员将DS来源的hnbMOs用GFP标记，对照hnbMOs用mCherry标记，并与人胎儿皮层切片共培养。共培养2周后，DS hnbMOs的GFP+纤维显著少于对照的mCherry+纤维，表明投射缺陷主要源于DS来源hnbMOs中的神经元异常，而非目标hCO。

进一步研究发现，DS hnbMOs和胎儿大脑中的神经突长度均减少，活细胞成像显示神经突生长速率降低，表明DS CHNs的生长和发育受损。MEA分析显示DS hnbMOs中峰电位数量减少，表明功能受损。这些发现表明CHNs的发育缺陷是其向hCO投射受损的关键因素。

为了在体内验证这些发现，研究人员将对照和DS hnbMOs移植到小鼠大脑中。移植后3个月，对照和DS hnbMOs在小鼠nbM区域均表现出强大的存活能力。免疫荧光显示，移植的DS hnbMOs中CHAT⁺hN⁺神经元的最长神经突较对照组减少，且移植DS hnbMOs的小鼠皮层中观察到较少的人源神经突，与组装体中观察到的投射缺陷一致。

研究结论与意义

本研究成功构建了富含功能性CHNs的hnbMOs，并在此基础上生成了nbM-皮层组装体，证实其可形成功能性神经连接。创新的双移植技术首次在移植小鼠体内重建了完整的人源胆碱能通路，为研究神经退行性和神经发育障碍提供了重要平台。

该研究的突破性在于：首先，与主要产生中间神经元群体的传统MGE类器官方案不同，通过结合增强的SHH信号和β-NGF补充，成功生富含CHNs的hnbMOs，代表了与传统MGE模型不同的谱系输出。其次，转录组数据表明hnbMOs与人和小鼠大脑的nbM区域高度匹配，而与其他MGE衍生核团相似性较低，确保了模型的特异性。最重要的是，双移植技术克服了传统单区域移植的局限性，首次在小鼠体内建立了具有同源投射起始和终止区域的完整人源神经通路。

在疾病建模方面，研究证实hnbMOs和nbM-皮层组装体能有效模拟DS相关的投射缺陷和神经活动异常。单细胞RNA测序分析揭示，DS hnbMOs中轴突投射中断可能归因于ANK3和NCAM2等轴突相关分子的失调。这些发现为理解DS神经发育缺陷的分子机制提供了新视角。

除了投射缺陷，研究人员还观察到DS iPSCs来源的nbM类器官中GABA比例显著增加，这一神经元亚型组成的转变可能会破坏兴奋/抑制平衡，影响神经元网络的关键功能特性。MEA记录显示DS nbMOs的神经元兴奋性降低，峰电位活动和爆发峰电位活动减少，表明GABA能/胆碱能比例改变可能导致DS中的网络级缺陷。

值得注意的是，该研究构建的hnbMOs提供了稳定的ACh输出，可作为研究神经元-癌症相互作用的更精细模型。例如，最近有研究表明基底前脑的CHNs能快速整合到胶质母细胞瘤中并促进肿瘤生长，揭示了BFCNs在肿瘤生物学中以前未被认识的作用。

尽管本研究取得了显著进展，但仍存在一些局限性。类器官的成熟度仍有限，可能影响CHNs功能和连接性的完全重现。未来的研究应整合上游脑区类器官与hnbMOs和hCOs，以阐明调控机制及其对疾病表型的潜在贡献。

总的来说，这项工作为模拟人类nbM及相关神经通路障碍提供了新途径，为理解神经系统疾病的发病机制和开发治疗策略奠定了坚实基础。该模型平台不仅适用于阿尔茨海默病和唐氏综合征，还有潜力扩展到其他涉及胆碱能系统功能障碍的神经系统疾病研究，具有广泛的科学价值和临床应用前景。