在中国开发并评估一种手工制作的侧向流动免疫测定方法，用于快速检测产生碳青霉烯类抗生素的革兰氏阴性细菌

《Infection and Drug Resistance》：Development and Evaluation of a Handmade Lateral Flow Immunoassay for the Rapid Detection of Carbapenem-producing Gram-Negative Bacteria in China

碳青霉烯酶产生微生物（CPOs）的快速检测新方法——手工侧流层析免疫吸附试验（LFIA）的开发与评估。该研究通过自行制备靶向KPC、IMP、NDM、VIM和OXA-48的 monoclonal antibodies，构建了新型LFIA检测流程，经26株CPE和105临床分离株验证，灵敏度100%，特异度95.3%，检测时间15分钟，成本显著低于传统PCR/NGS方法，且无交叉反应或干扰物质影响。该方法为资源受限地区提供了快速可靠检测CPOs的解决方案。

　　随着全球范围内碳青霉烯酶产生菌（CPOs）的快速传播，这种病原体对公共卫生构成了严重威胁。碳青霉烯酶能够水解多种β-内酰胺类抗生素，包括常被用作最后手段治疗严重感染的碳青霉烯类药物，因此，快速、经济有效的诊断工具对于指导抗菌治疗、遏制耐药性扩散具有重要意义。当前，许多临床机构仍在依赖传统的诊断方法，如聚合酶链式反应（PCR）和下一代测序（NGS），但这些方法通常耗时较长，需要专门的设备和技术人员支持，限制了其在资源有限地区的应用。为应对这一挑战，研究人员开发了一种基于侧向流动免疫分析（LFIA）的快速检测流程，旨在实现对碳青霉烯酶的高效识别。

LFIA技术是一种基于抗原-抗体反应的快速诊断工具，其原理是通过特定的单克隆抗体来检测样本中目标抗原的存在。当样本中存在目标抗原时，会与检测线上的抗体结合，形成可见的信号，从而实现快速判断。LFIA具有操作简便、成本低廉、无需复杂设备等优势，因此在临床微生物学实验室和资源有限的医疗环境中具有广泛应用潜力。本研究中，研究人员利用单克隆抗体特异性识别五种常见的碳青霉烯酶：KPC、IMP、NDM、VIM和OXA-48，构建了一种手工制作的LFIA检测流程。该流程不仅在实验室环境中表现优异，还能够在实际临床样本中快速、准确地检测出耐药菌株。

在实验设计方面，研究人员使用了26株经过验证的碳青霉烯酶产生肠杆菌（CPE）菌株，以及105株临床分离菌株，对LFIA的性能进行了全面评估。通过与PCR和NGS结果进行对比，LFIA在所有检测指标上均表现出卓越的性能，包括100%的灵敏度、100%的特异性、93.2%的阳性预测值（PPV）、100%的阴性预测值（NPV）以及97.1%的总体准确性。这些数据表明，LFIA在检测CPOs方面具有高度的可靠性，能够准确识别所有目标碳青霉烯酶类型，同时避免对非目标菌株的误判。

为了确保LFIA的诊断能力，研究人员还进行了检测限（LoD）评估，确定了每种碳青霉烯酶的最低可检测浓度。结果显示，KPC的LoD为≤600 pg/mL，IMP为≤200 pg/mL，NDM为≤150 pg/mL，VIM和OXA-48均为≤300 pg/mL。这些数值表明，LFIA能够有效检测出临床相关浓度范围内的碳青霉烯酶，从而为早期诊断提供支持。此外，研究人员还评估了LFIA的交叉反应性和潜在干扰因素，结果显示该方法在检测过程中未出现对非目标菌株或干扰物质的交叉反应，进一步证明了其高特异性。

在临床应用方面，LFIA的快速检测能力（15分钟内完成）和成本效益使其成为一种理想的诊断工具。传统方法如PCR和NGS通常需要数小时甚至数天才能完成检测，而LFIA能够在短时间内提供结果，从而帮助临床医生更快地制定治疗方案。对于病情危重的患者而言，及时识别耐药菌株至关重要，因为这可以避免使用无效的抗生素，减少治疗失败的风险，并防止耐药菌株在医疗机构内的传播。此外，LFIA的简便操作流程也使其在资源有限的医疗环境中具有重要价值，能够降低对专业设备和技术人员的依赖，提高诊断的可及性。

本研究的另一重要发现是，LFIA在检测临床样本时表现出良好的一致性和稳定性。通过对105株临床分离菌株的分析，研究人员确认了其中44株为CPOs阳性，其检测结果与PCR和NGS结果高度一致，仅有8例存在基因型差异。这些差异可能源于PCR引物设计或NGS测序深度等技术因素，但整体上并未影响LFIA的诊断准确性。同时，研究人员还通过Vitek2抗菌药物敏感性试验（AST）验证了LFIA结果与实际耐药性之间的关联，结果显示LFIA能够准确反映碳青霉烯酶的产生情况，并与实际的耐药性数据保持一致。

LFIA的高灵敏度和特异性使其在临床诊断中具有重要价值。对于需要快速识别病原体的临床场景，LFIA能够提供及时、准确的检测结果，从而支持更有效的抗菌治疗策略。此外，LFIA的高检测限确保了其在低浓度样本中的应用能力，这在早期诊断和耐药性监测中尤为重要。同时，该方法在不同样本类型（如全血、唾液、尿液）中的表现也证明了其在复杂临床环境中的适用性。研究人员还特别关注了LFIA在检测过程中是否会受到治疗药物的干扰，结果显示该方法对常用的抗生素如美罗培南、亚胺培南、多利培南、厄他培南和头孢曲松等均无干扰，进一步增强了其在实际应用中的可靠性。

尽管LFIA表现出色，但研究人员也指出了一些局限性。例如，本研究主要针对特定的碳青霉烯酶基因型，对于某些较少见的酶类型（如VIM和OXA-48）样本量较小，可能影响结果的普遍适用性。此外，研究仅在一家医院的样本中进行，未能涵盖更广泛的地理和临床背景。因此，未来的研究需要扩大样本来源，涵盖更多不同地区和医疗机构的菌株，以验证LFIA在多样化环境中的诊断能力。同时，针对新出现的耐药变异体进行检测和验证也是必要的，以确保该方法能够应对不断变化的耐药性格局。

从实际应用的角度来看，LFIA不仅能够提高临床诊断的效率，还能在抗菌药物管理方面发挥重要作用。通过快速识别耐药菌株，医疗机构可以更精准地选择合适的抗生素，减少不必要的药物使用，从而降低耐药性进一步扩散的风险。此外，LFIA的普及和推广有助于加强感染控制措施，防止耐药菌株在医院内传播，保护医护人员和患者的安全。对于资源有限的地区而言，LFIA的低成本和易操作性使其成为一种可行的替代方案，能够弥补传统方法在技术、设备和时间上的不足。

综上所述，本研究开发的LFIA检测流程在检测碳青霉烯酶方面表现出优异的性能，具备高灵敏度、高特异性、快速和低成本等优势。其结果与PCR和NGS高度一致，证明了其在临床诊断中的可靠性。同时，LFIA的简便操作流程和对多种干扰物质的耐受性使其在实际应用中具有广泛前景。然而，为了进一步推广该技术，仍需在更大规模、更多样化的样本基础上进行验证，并结合多中心研究，以确保其在不同地区和医疗环境中的适用性。未来的研究应重点关注如何优化LFIA的设计，使其能够覆盖更多耐药变异体，并在实际临床工作中实现更广泛的使用。通过持续改进和推广，LFIA有望成为对抗碳青霉烯酶耐药性的重要工具，为全球抗菌药物管理提供支持。