全面分析揭示了与糖尿病周围神经病变相关的生物标志物及其分子机制

《International Journal of General Medicine》：Comprehensive Analysis Reveals Biomarkers Related to Diabetic Peripheral Neuropathy and Its Molecular Mechanism

糖尿病周围神经病变（DPN）早期诊断缺乏准确生物标志物，本研究通过转录组学筛选差异表达基因（DEGs），结合孟德尔随机化（MR）验证因果关联，并利用RT-qPCR验证表达。共识别124个DE-DPN-RGs，其中TNF为保护因子，OSBPL8、IER3、SLC16A3、CREB5、LRWD1为风险因子。经多变量MR和表达验证，最终确定SLC16A3、CREB5、OSBPL8、LRWD1为DPN生物标志物，其功能涉及代谢、翻译及炎症通路，并预测了相关靶向药物。

　　糖尿病周围神经病变（DPN）是糖尿病最常见的并发症之一，影响了大约一半的糖尿病患者。随着全球糖尿病患病率的上升，DPN的疾病负担也日益加重，对公共卫生系统构成了严峻挑战。由于DPN缺乏准确的早期诊断指标，研究者们开始尝试通过转录组学和孟德尔随机化（MR）方法联合识别潜在的生物标志物，以指导DPN的预防和治疗策略。本研究通过整合转录组测序数据与MR分析，探讨了差异表达基因（DEGs）与DPN发病机制之间的相关性和因果关系，为揭示DPN的分子机制和发现新的治疗靶点提供了重要依据。

### 一、研究背景与目的

DPN的临床表现包括异常感觉或疼痛，如刺痛、麻木和灼烧感，这些症状往往伴随抑郁、焦虑和睡眠障碍。由于周围神经功能的丧失，DPN最初影响最长的神经纤维，并逐渐从远端向近端发展，最终可能导致残疾，严重影响患者的生活质量，并给患者及其医疗系统带来巨大的经济和心理负担。因此，早期和及时的诊断和治疗对于改善临床预后至关重要。然而，目前DPN的诊断主要依赖神经传导研究（NCS），这种方法虽然被认为是金标准，但其操作繁琐、耗时且成本高昂，难以在临床中广泛使用。鉴于缺乏明确的早期诊断标志物，以及对DPN发病机制理解的不足，迫切需要寻找更有效的生物标志物，以实现早期检测和深入研究其分子机制。

本研究的目的是利用转录组学和MR方法，系统性地筛选出与DPN具有显著因果关系的生物标志物。通过分析GSE95849和GSE185011两个公开数据集中的差异表达基因，结合MR分析，我们确认了六种候选生物标志物，其中四种在训练集和验证集中均表现出显著的表达差异，并且表达趋势一致，因此被认定为DPN的生物标志物。这些生物标志物不仅参与DPN的发病机制，还可能在其他糖尿病相关疾病和癌症中发挥重要作用，为DPN的治疗和预防提供了新的思路。

### 二、研究方法与数据来源

本研究的数据主要来源于两个公开的基因表达数据库，GSE95849和GSE185011。GSE95849（GPL22448）被选为训练集，包含6名DPN患者和6名健康对照的血液样本。GSE185011（GPL24676）作为验证集，包括5名DPN患者和5名健康对照的血液样本。此外，研究还使用了IEU OpenGWAS数据库，以获取与DPN相关的表达数量性状位点（eQTL）数据，用于MR分析。

为了筛选出与DPN相关的差异表达基因（DE-DPN-RGs），研究首先通过“limma”软件包对两个数据集中的基因表达数据进行差异分析，筛选出差异倍数变化（|log2FC| > 1）且调整后p值小于0.05的基因。随后，通过Venn图对两个数据集中的差异表达基因进行交集分析，最终获得了124个DE-DPN-RGs。这些基因的功能和信号通路通过基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析进行深入研究，进一步揭示了其在DPN发病机制中的作用。

为了确保MR分析的可靠性，研究采用了多种方法进行验证，包括异质性测试、水平多效性检验、Steiger测试等。这些测试帮助排除了反向因果关系和混杂因素的影响，从而增强了研究结果的可信度。此外，研究还通过散点图、森林图和漏斗图等可视化手段，展示了候选生物标志物与DPN之间的因果关系。

### 三、关键生物标志物及其生物学功能

通过MR分析，研究确认了六种与DPN具有显著因果关系的基因，包括TNF、OSBPL8、IER3、SLC16A3、CREB5和LRWD1。其中，TNF被发现是DPN的保护性因素，而其余五种基因则被鉴定为DPN的风险因素。通过RT-qPCR对这四个具有显著表达差异的生物标志物进行验证，结果表明它们在DPN患者中的表达水平明显高于健康对照组，而OSBPL8的表达差异未达到统计学显著性，这可能与样本量较小有关。

在生物学功能方面，这些生物标志物主要参与代谢反应、rRNA加工和翻译等关键过程。例如，SLC16A3（MCT4）属于单羧酸转运蛋白（MCT）家族，负责乳酸和丙酮酸等单羧酸的转运。研究表明，乳酸在周围神经的代谢过程中可能发挥重要作用，而DPN涉及周围神经系统多个细胞的代谢功能障碍和能量耗竭。因此，SLC16A3可能通过影响乳酸代谢，进而参与DPN的发病机制。此外，CREB5属于cAMP反应元件结合蛋白（CREB）家族，具有调节细胞存活、增殖和葡萄糖代谢的功能。研究发现，CREB5在糖尿病患者的近端肾小管上皮细胞中显著激活，并可能通过调节MET信号通路影响DPN的进展。

LRWD1是一种与异染色质复制相关的ORC复合体蛋白，其在DPN中的作用尚不明确，但本研究首次发现其与DPN存在关联。OSBPL8属于氧化甾醇结合蛋白样（OSBPL）家族，参与脂质运输和胆固醇水平的调控。已有研究表明，miR-143可以通过抑制OSBPL8的表达，影响胰岛素诱导的AKT激活和葡萄糖稳态，因此推测OSBPL8可能通过miR-143-ORP8通路影响DPN的进展。

### 四、生物标志物的分子调控网络

为了进一步探讨这些生物标志物的分子调控机制，研究构建了竞争性内源RNA（ceRNA）调控网络和转录因子（TF）-mRNA-miRNA调控网络。通过整合miRDB和TargetScan数据库的预测结果，研究发现了与生物标志物相关的54种miRNA和759种长链非编码RNA（lncRNA）。其中，HSA-miR-23a-3p在糖尿病患者中显著减少，其通过抑制NF-κB通路，可能减少促炎因子的表达，从而减轻DPN中的神经炎症反应。此外，HSA-miR-495-3p在长期高血糖和代谢综合征患者中被发现下调，可能通过调控免疫和炎症反应影响DPN的进展。这些miRNA可能作为DPN的潜在治疗靶点。

研究还发现，CREB5和OSBPL8相关的转录因子包括PBX3、ETS1、EP300、CREBBP和BRD4。其中，EP300和CREBBP已被证实与DPN诊断相关，可能通过调控脂质代谢毒性或炎症反应影响DPN的进展。BRD4则在高血糖诱导的心肌细胞肥大中起关键作用，可能通过AKT通路影响DPN的发病机制。这些发现为理解DPN的分子机制提供了新的视角，并为未来的治疗策略提供了潜在的靶点。

### 五、生物标志物的亚细胞定位与m6A甲基化

为了进一步揭示这些生物标志物在细胞内的作用，研究通过mRNALocater在线工具预测了它们的亚细胞定位，并分析了它们是否受到N6-甲基腺苷（m6A）修饰的影响。结果显示，SLC16A3、CREB5和LRWD1主要定位于细胞质，而OSBPL8则在细胞外被发现。此外，这些基因的m6A修饰位点也被预测出来，表明它们的表达和功能可能受到m6A修饰的调控。这种修饰在基因表达调控中具有重要作用，可能影响这些生物标志物的稳定性、翻译效率和信号传导过程。

### 六、潜在的治疗药物

基于生物标志物的功能分析和调控网络，研究还预测了可能用于DPN治疗的药物，包括他汀类药物（如罗苏伐他汀）、硝基呋喃肼和溴新斯的明。罗苏伐他汀因其抗纤维化特性，被认为可能通过抑制炎症反应和纤维化过程，缓解DPN的症状。溴新斯的明则通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性，延长乙酰胆碱在神经末梢的作用时间，从而增强神经兴奋性，可能对DPN的治疗具有潜在价值。这些药物的筛选不仅有助于开发新的治疗策略，也为临床实践提供了新的方向。

### 七、研究的局限性与未来展望

尽管本研究取得了一定成果，但仍然存在一些局限性。首先，研究基于公开数据集进行分析，可能受到样本选择偏差的影响，因此需要进一步在不同人群中进行验证。其次，尽管已经筛选出潜在的生物标志物和治疗药物，但它们的分子机制仍需通过功能性和实验性研究进行深入探讨。此外，治疗药物的临床应用还需要大规模的临床试验以验证其安全性和有效性。

总体而言，本研究通过整合转录组学和MR分析，成功筛选出与DPN具有显著因果关系的生物标志物，并揭示了其在DPN发病机制中的潜在作用。这些发现不仅有助于早期诊断和治疗策略的制定，还为理解DPN的分子机制提供了新的视角。未来的研究应进一步验证这些生物标志物的临床价值，并探索其在其他糖尿病相关疾病和癌症中的治疗潜力。