纳米封装技术降低了百里酚在人类细胞和斑马鱼胚胎中的毒性

《International Journal of Food Properties》：Nanoencapsulation mitigates the toxicity of thymol in human cells and zebrafish embryos

茶树酚纳米封装显著降低其细胞毒性和胚胎毒性，在人类正常及癌细胞系和斑马鱼胚胎模型中，游离茶树酚（IC50 57-194 μg/mL）呈浓度依赖性细胞毒性，而纳米封装形式（MNCT和LNCT）IC50超过501 μg/mL，对心脏功能、运动行为和胚胎存活率影响较小，LNCT在900 μg/mL仍安全。

　　本研究旨在评估自由态的百里香酚（FT）与单层纳米胶囊（MNCT）和层层自组装纳米胶囊（LNCT）在正常人源细胞系（如MCF10A、HaCaT、HdFn）和癌细胞系（如MDA-MB-231、A549、HT-29、HCT-116）中的细胞毒性，并进一步在斑马鱼胚胎中评估这些制剂的急性毒性和器官特异性毒性。实验采用了Alamar Blue检测方法，用于衡量细胞活力的变化。研究结果表明，自由态百里香酚在细胞系中表现出浓度依赖性的毒性，其半数抑制浓度（IC??）范围在57-194 μg/mL之间，这使得它被归类为中等毒性（依据美国国家癌症研究所的标准）。相比之下，MNCT和LNCT的IC??值均高于501 μg/mL，表明它们在这些细胞系中表现出非毒性特征。此外，在斑马鱼胚胎的体内毒性测试中，自由态百里香酚的半数致死浓度（LC??）为47.0 μg/mL，而MNCT和LNCT的LC??值分别为880.7 μg/mL和>900 μg/mL，表明纳米封装显著降低了百里香酚的毒性。最低无影响浓度（NOEC）也显示了类似趋势，即自由态百里香酚的NOEC为25 μg/mL，而MNCT为300 μg/mL，LNCT则为>900 μg/mL。因此，可以将自由态百里香酚归类为轻微毒性，而MNCT和LNCT则被认为是实际无毒的（根据美国鱼类和野生动物管理局的分类标准）。值得注意的是，MNCT和LNCT还能够逆转百里香酚导致的斑马鱼胚胎孵化率下降。这与功能测试结果一致，显示自由态百里香酚在≤50 μg/mL浓度下显著影响斑马鱼的运动能力、心跳频率和血液循环，而MNCT需要>100 μg/mL才能影响运动能力，而LNCT则需要>300 μg/mL和>900 μg/mL才能对心脏功能产生影响。特别值得注意的是，LNCT在所有测试功能中均表现出无毒性，最高测试浓度为900 μg/mL。这些结果表明，纳米封装显著减轻了百里香酚在人类细胞和斑马鱼胚胎中的毒性，尤其是LNCT，它可能通过控制释放机制提供了更优的保护效果。这些发现强调了百里香酚纳米胶囊作为食品和其他应用中潜在的更安全、更有效的递送系统的前景。

百里香酚是植物精油（EOs）中的主要萜烯类化合物，来源于唇形科植物（如百里香、牛至、鼠尾草、薄荷、薰衣草）。EOs因其独特的生物特性，以及对天然、绿色和可生物降解替代品的需求而受到越来越多的关注。然而，在食品和环境工业中使用百里香酚仍然面临一定的技术挑战，这主要归因于其较差的物理化学性质，包括脂溶性、高挥发性和低稳定性。这些特性限制了百里香酚作为天然防腐剂和抗菌剂的有效性，因为它容易快速蒸发并降解，从而削弱其生物活性潜力。为了解决这些问题，纳米封装技术被提出作为增强活性化合物生物利用度和稳定性的有效策略。纳米封装通过形成纳米级的胶囊结构，将活性成分包裹在保护层中，从而显著提高其溶解度和生物利用度。同时，这种技术可以有效减少活性成分的降解和挥发，通过物理屏障来抵御环境因素如热、光和氧气的影响。这种保护层不仅稳定了活性成分，还允许其在特定时间点释放，从而实现持续的递送效果。

在本研究中，我们开发了两种类型的百里香酚纳米胶囊：单层纳米胶囊（MNCT）和层层自组装纳米胶囊（LNCT）。MNCT由单一载体材料制成，设计用于快速释放EOs，而LNCT则使用两种载体材料，旨在实现更长时间的控制释放。为了评估自由态和纳米封装态百里香酚的毒性，我们采用Alamar Blue方法对不同的细胞系进行测试。结果显示，自由态百里香酚在所有细胞系中均表现出显著的细胞毒性，而MNCT和LNCT的细胞毒性则大大降低，甚至在最高浓度下也未观察到显著的细胞活力下降。这一发现表明，纳米封装可以显著减少百里香酚对人类细胞的毒性影响，保护大多数测试细胞系免受其毒性侵害，仅对新生纤维细胞（HDFn）有一定影响。这种差异可能与纤维细胞的膜组成和代谢活动不同有关，因为纤维细胞在伤口愈合和组织修复等过程中具有高度活跃的特性，可能更容易受到纳米封装态百里香酚对膜完整性的影响。

在斑马鱼胚胎中，自由态百里香酚表现出显著的毒性，其LC??值为47.0 μg/mL，而MNCT和LNCT的LC??值分别为880.7 μg/mL和>900 μg/mL。这表明纳米封装可以显著降低百里香酚的急性毒性。此外，NOEC值也显示了类似的趋势，自由态百里香酚的NOEC为25 μg/mL，而MNCT为300 μg/mL，LNCT则为>900 μg/mL。这些结果进一步支持了纳米封装在减轻百里香酚毒性方面的有效性。值得注意的是，MNCT在较高浓度下表现出一定的毒性，而在LNCT的情况下，即使在900 μg/mL的浓度下，也未观察到显著的毒性效应。这种差异可能归因于LNCT的多层结构，能够更有效地控制百里香酚的释放，从而在较高浓度下仍能维持较低的毒性水平。这些发现表明，单层封装在较低浓度下可能提供足够的保护，但在较高浓度下可能无法有效调控释放速率，导致急性毒性。

斑马鱼胚胎作为评估EOs及其成分的毒性和发育毒性的模型，因其与人类的高度遗传相似性、短生命周期、高繁殖率、透明性以及易于处理的特性而被广泛使用。在本研究中，我们采用OECD 236指南对自由态和纳米封装态百里香酚的急性毒性进行了评估。结果显示，自由态百里香酚在较低浓度下即可引起胚胎死亡和畸形，而纳米封装态百里香酚则表现出较低的毒性。此外，纳米封装还显著提高了胚胎的孵化率，表明其在发育过程中的安全性。这一结果支持了纳米封装作为增强百里香酚安全性的策略。

在功能测试中，自由态百里香酚在较低浓度下即可显著影响斑马鱼的运动能力、心跳频率和血液循环，而MNCT和LNCT则需要更高的浓度才能产生类似效果。这种差异可能与纳米封装态百里香酚的释放速率有关，即自由态百里香酚的快速释放可能使其在短时间内对胚胎产生较强的毒性效应，而纳米封装态百里香酚的缓慢释放则能够减少这种急性毒性。这一结果表明，纳米封装不仅能够降低百里香酚的急性毒性，还能够通过其控制释放机制，减少其对胚胎发育过程的干扰。

本研究还发现，纳米封装的百里香酚在斑马鱼胚胎中对心脏功能的影响显著低于自由态百里香酚。在自由态百里香酚暴露下，胚胎的心跳频率和血流速度在较低浓度（如12.5 μg/mL）下即可下降，而纳米封装态百里香酚则需要更高浓度（如600 μg/mL和900 μg/mL）才能对心脏功能产生显著影响。这表明，纳米封装能够有效减少百里香酚对心脏功能的直接损害，从而提高其在实际应用中的安全性。

此外，本研究还探讨了纳米封装对百里香酚毒性的潜在机制。自由态百里香酚直接与细胞膜的磷脂双分子层相互作用，其疏水性环结构插入膜内层，导致膜结构不稳定、膜流动性增加和膜弹性下降。这种破坏增加了细胞膜的通透性，导致细胞内成分泄漏，进而引发细胞损伤。内化的百里香酚还会破坏线粒体，干扰细胞的能量代谢，降低ATP水平，并增加活性氧（ROS）的产生，从而触发氧化应激和细胞凋亡。相比之下，纳米封装能够通过控制释放机制减少百里香酚对细胞膜的直接接触，从而降低其对细胞结构和功能的破坏。此外，多层结构的纳米胶囊（如LNCT）可能通过更有效的扩散屏障，进一步减缓百里香酚的释放速率，从而减少其在体内高浓度暴露的可能。

本研究的局限性在于，未对百里香酚引起的细胞凋亡途径或氧化应激标志物进行分子水平的机制研究。此外，虽然斑马鱼胚胎作为体内模型在评估早期发育毒性方面具有优势，但其生理特性与高等脊椎动物存在差异，因此研究结果在人类或哺乳动物中的直接转化仍需进一步验证。最后，纳米胶囊在实际应用环境中的稳定性和行为表现尚未进行评估，这可能影响其在食品基质或水环境中的实际安全性和有效性。因此，未来的研究应关注这些方面，以全面评估百里香酚纳米胶囊的适用性和转化潜力。

综上所述，本研究首次系统评估了自由态和纳米封装态百里香酚在多种人类细胞系以及斑马鱼胚胎中的毒性和发育毒性。结果表明，纳米封装能够显著降低百里香酚的毒性，使其在人类细胞和斑马鱼胚胎中表现出更高的安全性。特别是，层层自组装纳米胶囊（LNCT）提供了比单层纳米胶囊（MNCT）更优的保护效果，这可能与其更慢的释放速率有关。这些发现为百里香酚在食品和环境应用中的安全使用提供了重要依据，同时也为纳米封装技术在提高活性成分安全性方面的潜力提供了支持。未来的研究应进一步探索百里香酚纳米胶囊在不同细胞类型、其他水生生物以及哺乳动物模型中的安全性，以确保其在更广泛的应用场景中的可行性。