新型连接子实现STING激动剂环状二核苷酸的抗体偶联药物TAK-500的生物偶联

《Bioconjugate Chemistry》：Identification of a Novel Linker Enabling the Bioconjugation of a Cyclic Dinucleotide for the STING Antibody-Drug Conjugate TAK-500

本刊推荐：为解决STING激动剂全身给药可能引发的脱靶毒性及疗效窗口窄的问题，研究人员开展了针对CCR2+免疫细胞的抗体药物偶联物(ADC) TAK-500的开发。通过设计一种新型自消除连接子，将环状二核苷酸STING激动剂dazostinag与靶向CCR2的抗体TAK-202偶联，成功获得了具有良好血浆稳定性和快速细胞内 payload 释放特性的ADC。该研究为免疫激动剂的靶向递送提供了新的化学策略，显著增强了STING通路激活的特异性和抗肿瘤疗效，相关成果已进入临床一期试验。

　　

在肿瘤免疫治疗领域，PD-1和CTLA-4等免疫检查点抑制剂的出现无疑是一场革命。然而，临床实践中仍有大量患者对现有免疫疗法无应答，其核心困境在于肿瘤微环境（TME）中免疫细胞浸润不足，即所谓的“冷肿瘤”。如何将“冷肿瘤”转化为免疫细胞富集的“热肿瘤”，从而提升免疫治疗的效果，成为科学家们攻坚的焦点。其中，干扰素基因刺激因子（STING）通路因其在激活先天免疫反应中的核心作用而备受关注。STING的激活能诱导I型干扰素（IFN）和促炎细胞因子的产生，进而增强先天和适应性免疫应答。然而，STING激动剂的系统性给药存在显著风险，可能激活非肿瘤组织中的多种免疫细胞类型，导致严重的全身性炎症反应，限制了其治疗窗口。

为了突破这一瓶颈，靶向递送策略应运而生。抗体药物偶联物（ADC）技术能够像“生物导弹”一样，将高效的小分子药物精准投送至特定细胞。设想一下，如果能将STING激动剂专门递送到肿瘤内的关键免疫细胞——例如表达CCR2的免疫细胞——就有可能在不引起全身毒性的前提下，局部激活STING通路，重塑肿瘤免疫微环境。趋化因子受体2（CCR2）在单核细胞向炎症部位迁移中起关键作用，并在包括T细胞和髓系细胞在内的多种免疫细胞上表达。研究表明，在非小细胞肺癌（NSCLC）等多种肿瘤类型的肿瘤浸润免疫细胞中，CCR2表达上调，这使其成为理想的靶点。然而，将环状二核苷酸（CDN）类STING激动剂（如dazostinag, TAK-676）成功构建为ADC面临巨大挑战。这类分子结构独特，水溶性高，细胞渗透性差，且缺乏ADC连接子常用的偶联位点（如胺基、苯胺基或酚羟基），其合成和偶联化学极具难度。

针对这一难题，发表在《Bioconjugate Chemistry》上的研究报道了一项突破性进展：研究人员成功设计了一种新型连接子，首次实现了STING激动剂环状二核苷酸与靶向CCR2的抗体的高效、稳定偶联，从而开发出免疫细胞导向的抗体药物偶联物（iADC）TAK-500。这项研究不仅解决了CDN类分子作为ADC payload的化学偶联难题，更在临床前模型中展示了其卓越的靶向性和抗肿瘤活性。

为开展此项研究，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，进行了系统的连接子化学设计与合成，重点探索了基于Cathepsin B可切割的Val-Ala二肽连接子，并引入了关键的自消除间隔基以解决稳定性与释放效率的矛盾。其次，利用随机半胱氨酸偶联技术将优化后的连接子-payload与靶向CCR2的抗体（TAK-202）进行偶联，制备得到ADC。第三，通过体外细胞模型（如过表达CCR2的THP-1报告基因细胞系）评估ADC诱导STING通路激活的效力（EC₅₀）。第四，在人和小鼠等多种血浆样本中系统评估了ADC的血浆稳定性。最后，在荷瘤小鼠模型（如MC38同系肿瘤模型）和非人灵长类动物模型中进行了全面的药代动力学（PK）分析和体内药效学评价，以验证其靶向抗肿瘤活性。研究中所用的小鼠替代性ADC（mTAK-500）系通过类似方法，使用靶向小鼠CCR2的抗体与相同连接子-payload偶联制备。

连接子优化

研究人员首先确立了ADC连接子的两大核心标准：足够的血浆稳定性以防止payload提前释放，以及在内化进入溶酶体后能快速切割以释放活性payload。他们选择了广泛应用的Cathepsin B可切割的Val-Ala二肽连接子作为基础。然而，dazostinag缺乏传统的连接子手柄。初步尝试直接利用其磷酸硫酯基团或核糖上的仲羟基进行连接均告失败，前者化学稳定性差，后者合成挑战巨大。随后，他们将目光投向dazostinag腺嘌呤上的氨基。虽然直接连接Val-Ala二肽（中间体1）在化学上可行，但该结构不仅酰胺键在血浆中不稳定（pH 7, 37°C下6天释放25% payload），而且在溶酶体提取物中切割缓慢。更关键的是，在合成过程中，脱除Boc保护基会立即引发二肽的自消除，直接释放出游离的dazostinag。这一现象与文献中在胞嘧啶核苷上观察到的结果类似。受此启发，研究团队创新性地在可切割的Val-Ala二肽和腺嘌呤氨基之间引入了一个自消除间隔基。该设计使得在Cathepsin B切割连接子后，释放出的间隔基氨基会触发分子内环化，从而快速释放出游离的dazostinag。初步验证中间体2显示，其具有优异的化学稳定性（pH 7, 37°C下7天降解<5%），并在溶酶体提取物中能快速释放payload。然而，将基于此连接子的ADC（ADC1）在血浆稳定性测试中，却在人和小鼠血浆中观察到了意料之外的较快payload释放（4天后分别释放40%和30%）。这表明连接子中腺嘌呤氨基与间隔基之间的酰胺键可能对血浆中的酶解敏感。为了增强该酰胺键的稳定性，研究人员对间隔基进行了进一步改造，在酰胺键附近引入了一个苯环（连接子-payload 6和 9）。这一修饰不仅通过空间位阻和构象限制提高了酰胺键的酶解稳定性，还加速了切割后的自消除过程。最终优化的连接子-payload 9（含PEG链以调节亲疏水性）被成功用于构建TAK-500。体外实验证实，TAK-500在CCR2过表达的THP-1细胞中能高效激活STING通路（EC₅₀ < 1 nM），且在人、食蟹猴和小鼠血浆中均表现出卓越的稳定性（4天释放<10%）。该策略同样适用于另一个含鸟嘌呤的CDN分子10，证明了其普适性。

TAK-500在小鼠和非人灵长类动物中显示出可接受的PK特征

对TAK-500的药代动力学评估显示，其抗体部分在小鼠和食蟹猴体内均表现出长半衰期（40–60小时）。结合payload的浓度虽也呈现持续暴露，但其清除速率快于抗体，导致体内DAR值在7天内从4下降至接近1。尽管如此，结合payload的暴露量被认为足以维持持续的体内药效和疗效。值得注意的是，在食蟹猴中，仅在3 mg/kg剂量组给药后1小时检测到高于定量限的游离dazostinag，表明连接子在体内足够稳定，能最大限度地减少payload提前释放导致的脱靶毒性风险。与未偶联的抗体TAK-202相比，TAK-500中抗体部分的PK参数基本一致，说明偶联过程对抗体本身的动力学性质影响较小。

分离的DAR物种TAK-500表现出相似的PK特征

通过疏水相互作用色谱（HIC）分离得到TAK-500的DAR 2、4、6和8物种，并分别在小鼠中进行了PK评估。出乎意料的是，尽管DAR 8物种的清除更快，但DAR 2、4和6物种的结合payload血浆暴露量（AUC）和清除率却非常相似，这与ADC领域中通常观察到的较高DAR物种因疏水性增加而清除加快的现象不同。由于DAR 8物种在TAK-500中占比不足5%，因此其对整体PK谱的影响有限。这一结果表明TAK-500中较高的DAR物种在血浆PK方面不具有明显的劣势。

阻断逆迈克尔型马来酰亚胺解离并未改善体内结合payload的暴露

为了评估逆迈克尔反应导致的连接子-payload解离对PK的影响，研究人员制备了连接子-payload 12，其马来酰亚胺部分在与抗体偶联后可在温和条件下水解，形成不可逆的加合物，从而阻断解离。由此得到的ADC4在化学稳定性测试中（如高浓度谷胱甘肽存在下）表现远优于TAK-500。然而，在小鼠体内PK研究中，ADC4与TAK-500的PK参数（包括结合payload的清除率和解离速率）几乎完全相同。这表明，对于TAK-500而言，阻止连接子-payload的解离并未带来明显的PK改善。这可能意味着体内存在连接子-payload解离之外的、更主要的清除机制，例如结合在抗体上的payload被血浆中的水解酶（如ENPP1）降解，而体外血浆稳定性实验未能完全模拟这一过程。

小鼠替代抗体药物偶联物mTAK-500的制备

由于TAK-500的抗体TAK-202不结合小鼠CCR2，为进行小鼠体内药理学研究，研究人员制备了小鼠替代ADC（mTAK-500）。他们使用靶向小鼠CCR2的mIgG2a抗体（RtMuMC-21-S98）与连接子-payload 9进行偶联。初始尝试采用标准还原条件效果不佳，产生了大量未偶联抗体和高DAR物种。通过采用完全还原/部分氧化（使用脱氢抗坏血酸DHAA）的策略对抗体进行预处理，最终成功获得了DAR分布与TAK-500相似的小鼠替代ADC。

mTAK-500表现出可接受的PK特征并产生体内抗肿瘤活性

在携带MC38同系肿瘤的C57BL/6小鼠中，单次静脉注射mTAK-500后，观察到了抗体和结合dazostinag的持续血浆暴露。药效学实验显示，mTAK-500在低至5 μg/kg（基于payload剂量）的剂量下即可观察到肿瘤缩小，且效果优于同型对照ADC，证明了其抗肿瘤活性是靶点驱动性的。值得注意的是，要达到显著的体内疗效，未偶联的dazostinag需要高达1–2 mg/kg的剂量，是mTAK-500有效剂量的100倍以上，凸显了靶向递送在增强疗效方面的巨大优势。同时，mTAK-500治疗还诱导了IP-10、CCL2 (MCP-1)、IFNα、TNFα、IL-6和IFNγ等免疫刺激细胞因子的剂量依赖性增加，这可能是其驱动抗肿瘤活性的关键机制。

结论

本研究成功开发了一种创新的化学策略，用于将STING激动剂dazostinag通过优化的连接子偶联至靶向CCR2的抗体上，从而构建出iADC TAK-500。该策略的核心在于在Cathepsin B可切割的Val-Ala连接子和dazostinag的腺嘌呤氨基之间引入了一个经过合理设计的自消除间隔基，最终获得的连接子-payload 9及其ADC产物TAK-500兼具良好的血浆稳定性和快速的细胞内payload释放能力。TAK-500在临床前模型中展示了可接受的PK特征和强大的靶向抗肿瘤活性。通过靶向递送，TAK-500实现了远超游离STING激动剂的疗效和治疗指数，为利用免疫激动剂治疗肿瘤，特别是克服对免疫检查点抑制剂的耐药性提供了新的有力工具。基于这些令人鼓舞的临床前数据，TAK-500已进入临床一期试验阶段，其未来表现值得期待。