PEG化驱动的PLGA纳米颗粒蛋白冠重塑：对巨噬细胞识别的影响及其机制研究

《Biomacromolecules》：PEGylation-Driven Remodeling of the Protein Corona on PLGA Nanoparticles: Implications for Macrophage Recognition

本研究针对纳米颗粒表面蛋白冠(PC)形成机制及其对免疫识别影响的关键问题，系统探讨了PEG表面密度对PLGA纳米颗粒蛋白冠组成的调控作用。研究人员通过优化蛋白冠分离方法，结合蛋白质组学分析和巨噬细胞摄取实验，揭示了PEG密度通过调节调理素/抗调理素平衡而非单一蛋白相互作用来影响纳米颗粒生物学命运的重要机制，为理性设计纳米载体的免疫识别特性提供了新见解。

　　

在纳米医学快速发展的今天，纳米颗粒作为药物递送载体展现出巨大潜力，但其在生物体内的命运却受到一个关键因素的制约——蛋白冠的形成。当纳米颗粒进入生物环境后，会立即被蛋白质"包裹"，形成动态的蛋白冠层，这个"生物身份"决定了纳米颗粒如何与免疫系统相互作用。特别是巨噬细胞作为免疫系统的"哨兵"，对纳米颗粒的识别和清除起着决定性作用。

为了克服这一挑战，研究人员通常采用聚乙二醇(PEG)修饰策略来减少蛋白吸附，延长纳米颗粒的循环时间。然而，PEG表面密度与蛋白冠组成之间的精确关系，以及这种关系如何影响巨噬细胞对纳米颗粒的识别，仍然是领域内亟待解决的关键科学问题。

来自那不勒斯腓特烈二世大学的研究团队在《Biomacromolecules》上发表了重要研究成果，系统阐明了PEG化驱动的PLGA纳米颗粒蛋白冠重塑机制及其对巨噬细胞识别的影响。该研究不仅揭示了PEG表面密度与蛋白冠组成的复杂关系，还发现了与传统认知相悖的现象——更高程度的PEG化反而导致了更快的巨噬细胞摄取，这一发现对纳米药物的理性设计具有重要指导意义。

研究人员主要采用了纳米颗粒制备与表征、蛋白冠分离优化、蛋白质组学分析和巨噬细胞摄取实验等关键技术方法。其中骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)来自C57BL/6小鼠，通过纳米液相色谱-质谱联用技术进行蛋白冠的定性定量分析。

实验结果

PEG化PLGA纳米颗粒的性质

研究人员成功制备了三种不同PEG比例的PLGA纳米颗粒(PEG30、PEG50、PEG70)，其流体动力学直径(D_H)在95-140纳米范围内，多分散指数(PDI)约为0.1，表面电荷(ζ)约为-30毫伏。通过¹H NMR分析发现，实际暴露在表面的PEG量显著低于理论值，特别是PEG70纳米颗粒的实际PEG表面密度仅为理论值的一半左右。

PLGA纳米颗粒蛋白冠分离的优化

研究比较了离心、尺寸排阻色谱(SEC)和微滤三种蛋白冠分离方法。结果表明，300kDa微滤法在蛋白质回收率和纳米颗粒回收率方面均优于其他方法，能够更好地保持蛋白冠的原位结构和组成，因此被选为后续研究的标准方法。

PLGA/PEG_2k-PLGA_2k纳米颗粒蛋白冠的特征

蛋白冠分析显示，随着PEG含量的增加，纳米颗粒表面吸附的蛋白质总量显著减少。蛋白质组学鉴定出约300种蛋白质，其中65%的蛋白质为三种纳米颗粒所共有。基因本体分析表明，这些蛋白质主要参与血液凝固、补体激活和细胞粘附等生物过程。

巨噬细胞中的摄取

令人意外的是，尽管PEG70纳米颗粒吸附的蛋白质总量最少，但其在骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)中的摄取速率和程度却最高。流式细胞术和共聚焦显微镜观察均证实，PEG70纳米颗粒在1小时和4小时的早期时间点就显示出更强的细胞内荧光信号。脂多糖(LPS)刺激实验进一步表明，这种摄取差异与巨噬细胞的激活状态无关。

讨论与结论

本研究通过系统关联PEG-PLGA纳米颗粒的化学特性、蛋白冠组成和巨噬细胞摄取行为，揭示了PEG化程度通过调节蛋白冠的定性组成而非单纯减少蛋白质吸附总量来影响纳米颗粒生物学命运的重要机制。研究发现，虽然PEG表面密度相近，但不同PEG化程度的纳米颗粒形成了具有显著差异的蛋白冠"指纹"，其中调理素与抗调理素的相对平衡而非单一蛋白质的相互作用，是决定巨噬细胞识别效率的关键因素。

特别值得注意的是，与传统认知相悖的是，更高程度的PEG化(PEG70)反而导致了更快的巨噬细胞摄取。这一看似矛盾的现象可以通过蛋白冠的定性组成差异得到解释：PEG70纳米颗粒表面富集了补体因子B、α-S1-酪蛋白等可能促进识别的蛋白质，同时抗调理素载脂蛋白A1(Apo-A1)的相对丰度较低，这种特定的蛋白质组合可能更有利于巨噬细胞受体的识别和内化。

该研究的创新之处在于强调了蛋白冠分离方法的重要性，建立了可靠的微滤分离流程，并首次系统揭示了PEG表面密度、蛋白冠组成和巨噬细胞摄取三者之间的复杂关系。这些发现对纳米药物的理性设计具有重要指导意义，提示在优化纳米载体时应综合考虑表面化学修饰和预期形成的蛋白冠特性，而不能仅仅依赖传统的"stealth"设计理念。

总之，这项研究深化了我们对纳米-生物界面相互作用的理解，为设计具有可控免疫识别特性的纳米药物提供了新的思路和实验依据。未来在人类血清中的进一步研究将有助于验证这些发现在临床相关场景中的适用性。