基于聚阳离子化铁蛋白纳米笼的肽核酸递送系统构建及其基因沉默效应研究

《Biomacromolecules》：Evaluation of Peptide Nucleic Acid Encapsulation in Ferritin Nanocages for Gene Silencing Applications

本研究针对肽核酸(PNA)水溶性差、细胞渗透性低等问题，开发了基于PA3.2-HumAfFt铁蛋白纳米笼的递送系统。通过二价阳离子触发寡聚化技术，成功实现了带负电荷PNA的高效装载（最高达5分子/铁蛋白）和pH/温度响应性释放（pH 5.0时释放效率达81.5%），并在MEG-01细胞中有效沉默GAPDH基因（沉默效率约45%），为PNA疗法应用提供了新策略。

　　

在精准医疗和分子诊断快速发展的今天，科学家们一直在寻找能够精准调控基因表达的有效工具。肽核酸（Peptide Nucleic Acid, PNA）作为一类人工合成的核酸类似物，因其独特的肽样中性骨架而备受关注。与天然的DNA或RNA相比，PNA具有更高的核酸酶抗性、更强的结合亲和力以及卓越的序列特异性，使其在基因治疗、化学生物学和诊断领域展现出巨大潜力。然而，PNA的中性骨架如同一把双刃剑，在赋予其优势的同时，也导致了其在水溶液中溶解度极低且难以穿透细胞膜的致命弱点，这严重限制了其在生物医学中的应用。

为了突破这一瓶颈，研究人员尝试了多种策略，包括将PNA与肽类修饰物连接或开发骨架修饰的PNA，但这些方法在结构控制、工程灵活性和生物相容性方面仍存在局限。与此同时，蛋白质纳米容器，特别是铁蛋白（Ferritin, Ft），为药物递送提供了创新平台。铁蛋白拥有天然的纳米笼结构，由24个相同的亚基组成，内部形成一个约8纳米大小的密闭空间，具有良好的结构完整性、遗传可操作性、易于化学修饰和优异的生物相容性。更为重要的是，铁蛋白能够通过癌细胞表面过度表达的转铁蛋白受体1（TfR1或CD71）被细胞有效摄取，这为靶向递送提供了可能。

近期，一种名为“人源化古菌铁蛋白”（Humanized Archaeoglobus Ferritin, HumAfFt）的嵌合构建体引起了研究人员的兴趣。这种蛋白质不仅保留了铁蛋白的纳米笼结构，还通过在其外部环区引入人源序列，使其能够被人TfR1受体识别，从而实现基于网格蛋白介导的内吞作用的靶向递送。此外，HumAfFt在生理pH下表现出不寻常的盐触发组装/解组装行为，并且每个亚基上含有一个半胱氨酸残基，允许使用可调试剂对内部表面进行永久性化学修饰。为了增强铁蛋白空腔对带负电的寡核苷酸的装载能力，研究人员开发了一种策略，通过化学交联环状多胺（如PA3.2 linker）来增加空腔的正电荷，从而促进通过静电相互作用的物理包裹。

在这项发表于《Biomacromolecules》的研究中，由Andrea Patrizia Falanga等人组成的团队旨在将这种基于电荷的包裹方法扩展到PNA的装载中。他们试图利用二价阳离子触发的寡聚化方法，将带有不同长度和净电荷（从正到负）的PNA装载到聚阳离子化的PA3.2-HumAfFt系统中，评估其装载性能、释放动力学以及最终的细胞摄取和基因沉默效果，为开发高效的PNA递送策略奠定基础。

为开展本研究，作者团队运用了几个关键的技术方法：首先，采用Fmoc固相合成法合成了系列带有不同电荷尾巴（如E4、E8、K6）的PNA序列，并通过HPLC纯化和ESI-MS进行表征。其次，通过分子生物学方法表达和纯化了HumAfFt蛋白，并优化了PA3.2 linker的合成工艺。再者，利用二价镁离子（MgCl₂）触发HumAfFt的组装/解组装过程，实现了PNA的封装，并通过超滤离心法纯化复合物。此外，研究还综合运用紫外-可见光谱（UV-Vis）定量装载量和释放量，动态光散射（DLS）和ζ电位分析纳米颗粒的物理化学性质，非变性凝胶电泳（Native-PAGE）验证复合物形成和结构完整性。在细胞水平，使用流式细胞术评估了MEG-01细胞（样本来源为ATCC）对FITC标记PNA的摄取情况，并通过实时定量PCR（qPCR）检测了GAPDH基因的沉默效率。

3.1. 设计合成化学多样性PNA载荷

研究人员设计合成了针对GAPDH mRNA特定序列的PNA。为了促进与PA3.2-HumAfFt系统内带正电linker的静电相互作用，他们在PNA的N端引入了带负电的谷氨酸残基（E4或E8），合成了PNA_10-mer E4 (?)和PNA_10-mer E8 (?)；同时合成了带正电的PNA_10-mer K6 (+)，以评估未修饰铁蛋白的装载能力。此外，还合成了全长的19-mer PNA类似物PNA_19-mer E4 (?)。所有PNA均标记FITC用于后续追踪。结论：成功制备了电荷和长度各异的PNA分子，为后续装载研究提供了材料基础。

3.2. 表征FITC PNA-HumAfFt复合物

通过测量不同PNA/铁蛋白比例下的装载量，发现电荷相互作用在封装中起关键作用。带负电的PNA（E4和E8）在PA3.2-HumAfFt中表现出优异的装载能力，其中PNA_10-mer E8 (?)饱和时可达平均5个PNA分子/铁蛋白，PNA_10-mer E4 (?)为4个分子/铁蛋白。而带正电的PNA_10-mer K6 (+)在未修饰的HumAfFt中装载量极低。对于更长的PNA_19-mer E4 (?)，最大装载量限制在0.8个分子/铁蛋白，表明铁蛋白空腔尺寸对较大刚性结构的容纳能力有限。DLS和ζ电位结果表明复合物形成后尺寸均一、稳定性良好。结论：PA3.2化学修饰显著增强了铁蛋白对带负电PNA的装载能力，且装载效率受PNA长度和电荷影响。

3.3. FITC–PNAs在（未）修饰HumAfFt中的封装效率

封装效率（EE）计算表明，PNA_10-mer E8 (?)最高（20.3 ± 2.0%），其次是PNA_10-mer E4 (?)（13.7 ± 1.0%），PNA_19-mer E4 (?)和PNA_10-mer K6 (+)较低（均为9.4%左右）。Native-PAGE分析证实FITC标记的PNA与铁蛋白纳米笼共迁移，表明成功封装。结论：带负电PNA与聚阳离子linker间的相互作用是高效封装的关键，且较长的PNA封装效率较低。

3.4. 封装FITC-PNAs从修饰HumAfFt中的释放

研究了温度和pH对PNA释放的影响。由于FITC在酸性pH下会发生荧光淬灭，研究首先验证了测量方法的可靠性。释放实验显示，在37°C、pH 7.5条件下，PNA_10-mer E4 (?)的释放效率为70.5 ± 2%；而在37°C、模拟溶酶体环境的pH 5.0条件下，释放效率进一步提高至81.5 ± 6%。结论：PA3.2-HumAfFt系统能够实现PNA的pH和温度响应性释放，尤其在酸性环境中释放更高效，模拟了细胞内吞后的释放过程。

3.5. FITC- PNA_10-mer E4 (?)负载PA-HumAfFt的细胞摄取

通过流式细胞术分析MEG-01细胞（高表达CD71）的摄取情况。结果显示，游离的FITC-PNA_10-mer E4 (?)无法被细胞有效摄取，荧光信号与阴性对照无差异；而封装在PA3.2-HumAfFt纳米笼中的PNA则显示出明显的荧光信号。结论：铁蛋白纳米笼是PNA实现细胞有效摄取的必要载体，其机制可能依赖于TfR1介导的内吞作用。

3.6. 铁蛋白封装PNA_10-mer E4 (?)靶向GAPDH的效率评估

通过qPCR检测GAPDH基因的表达水平。与游离PNA处理组相比，铁蛋白封装的PNA_10-mer E4 (?)处理使GAPDH表达降低了约45%，证明了其基因沉默活性。虽然其沉默效率与使用常规转染试剂递送的siRNA（RNAi-TX）相当，但铁蛋白系统提供了一种无需合成转染试剂的递送方式。结论：封装在PA3.2-HumAfFt中的PNA_10-mer E4 (?)能够在细胞内有效发挥基因沉默功能，证实了该递送系统的生物学有效性。

本研究成功证明，基于聚阳离子化PA3.2-HumAfFt铁蛋白纳米笼的递送系统能够高效封装带负电荷的肽核酸（PNA），并实现其在生理条件下的可控释放。研究揭示了PNA的电荷和长度是影响其封装效率的关键因素，其中带负电的短链PNA展示出最佳性能。该系统不仅能促进PNA的细胞摄取，还能在细胞内有效沉默靶基因（GAPDH）。这项研究的意义在于，它为解决PNA临床应用面临的主要障碍——递送问题——提供了一种新颖、生物相容性高且具有靶向潜力的解决方案。通过利用天然存在的铁蛋白载体和合理的化学修饰，该策略为优化基于PNA的 therapeutics 和拓宽其生物医学应用范围开辟了新的途径。