基于残基的热重分析：大分子中羧酸盐修饰定量的新方法

《Biomacromolecules》：Residue-Based Thermogravimetric Analysis: A Novel Method to Quantify Carboxylate Group Modifications in Macromolecules

本刊推荐：针对透明质酸(HA)化学修饰度(DoM)难以精确量化的问题，研究人员开发了一种基于热重分析(TGA)的新方法。通过对比未修饰的透明质酸钠(NaHA)与羧酸盐修饰HA衍生物的热分解残留物(Na2CO3)，实现了对四种不同HA衍生物（醛基、呋喃、硫醇及氰基乙酸酯）DoM的准确测定。该方法不依赖于待测基团的化学结构，尤其适用于传统光谱方法（如1H NMR/UV-vis）无法检测的“沉默基团”，为生物材料开发提供了强有力的无标记分析工具。

　　

在生物医学领域，源自细胞外基质的生物材料，特别是透明质酸，因其卓越的生物相容性和可修饰性，在组织工程、再生医学和药物递送系统中扮演着关键角色。然而，一个长期存在的“量化鸿沟”阻碍了其进一步发展：如何精确测定这些大分子，尤其是经过化学修饰后，其修饰程度的高低。修饰程度直接影响材料的物理化学性质，如粘度、交联密度和降解动力学，进而决定其最终生物学性能。传统的量化手段，如核磁共振、紫外-可见光谱和红外光谱，各有局限：核磁共振信号易重叠，紫外-可见光谱常需繁琐的标记步骤，而对于那些没有特征光谱信号的“沉默”修饰基团，这些方法更是束手无策。此外，当材料形成水凝胶或不溶于水时，溶液-based的分析方法便几乎失效。这种精确表征工具的缺失，尤其不符合医疗器械开发中严格的法规要求。

为了攻克这一难题，来自瑞典乌普萨拉大学的研究团队在《Biomacromolecules》上发表了一项创新研究，他们另辟蹊径，将目光投向了实验室中常见的热重分析仪。他们提出了一种名为“基于残基的热重分析”的新方法，其核心思想非常巧妙：不是去直接测量连接上去的化学基团（即“称量烧掉的部分”），而是精确测量高温氧化后剩下的无机残留物（即“称量剩下的部分”）。对于以钠盐形式存在的透明质酸，其每个二糖重复单元都含有一个羧酸盐基团，与钠离子结合。当样品在高温有氧环境下完全分解后，这些钠离子会以碳酸钠的形式残留下来。一旦羧酸盐基团被化学修饰，它就不再结合钠离子，因此最终形成的碳酸钠量就会相应减少。通过测量残留物的质量，并将其与未修饰的透明质酸钠进行对比，就能反向推算出被修饰掉的羧酸盐基团的比例，从而获得修饰程度。

为验证这一方法的普适性和准确性，研究人员合成了四种带有不同官能团的透明质酸衍生物：醛基修饰、呋喃修饰、硫醇修饰以及此前无法用光谱方法定量、属于“沉默基团”的氰基乙酸酯修饰。研究的关键步骤包括：首先，对样品溶液进行精细的pH调节，确保羧酸基团几乎完全离子化；接着，利用优化的热重分析程序，在严格控制的气氛和温度下，使样品经历干燥、热解和最终氧化，并精确记录残留质量；最后，通过理论计算模型，将测得的残留物百分比转化为修饰程度。

主要关键技术方法

本研究主要运用了有机合成化学方法制备了四种不同的透明质酸衍生物。核心分析技术是热重分析，并辅以傅里叶变换红外光谱和扫描电子显微镜-能量色散X射线光谱对热重分析残留物进行表征，以确认其成分为碳酸钠。此外，使用核磁共振氢谱和紫外-可见光谱（Ellman's assay）作为参照方法，验证热重分析结果对于可检测修饰基团的准确性。

3. 结果与讨论

3.1. HA衍生物的合成

研究人员成功合成了四种目标HA衍生物（HA-Ald, HA-Furan, HA-Thiol, HA-Cyano），为后续的方法验证提供了关键样品。其中，HA-Furan和HA-Thiol具有独特的NMR信号，可用于传统方法量化；HA-Ald需经过额外衍生化反应后才能用NMR定量；而HA-Cyano则完全缺乏可用的NMR或UV-vis特征信号，代表了最具挑战性的“沉默”修饰案例。

3.2. TGA作为测定HA衍生物DoM的方法

该部分阐明了方法的理论基础。研究指出，选择钠离子作为反离子是因为其与羧酸盐基团的高亲和力以及操作上的便利性。通过Henderson-Hasselbalch方程计算表明，在选定的pH条件下（7.5-8.0），HA的羧酸基团电离度超过99.99%，确保了定量关系的可靠性。同时，计算证明在此pH范围内，由溶液中游离钠离子形成的碳酸钠对总质量的贡献微乎其微，可忽略不计。

3.3. TGA方案和空白稳定性

研究人员建立了一套严谨且优化的TGA实验方案，包括长时间的干燥步骤和分阶段的热解/氧化过程，以确保水分完全去除和有机物彻底分解。通过多次空白实验，确定了仪器的基线误差极小（标准偏差±0.001 mg），证明了该方法具有极高的精密度和稳定性，为准确量化奠定了基础。

3.4. 校准天然HA以优化TGA定量方法

这是方法建立的核心环节。首先，通过对未修饰的NaHA进行多次TGA测量，确定了其平均实验残留值为12.56%，略低于理论计算值（13.21%），这归因于商业HA原料中存在的杂质。据此，他们校准并计算出了用于本研究的实际平均每个羧酸盐离子对应的摩尔质量（421.93 g/mol）。随后，通过建立的数学模型，将修饰后样品的残留物百分比换算为修饰程度。对HA-Furan、HA-Ald和HA-Thiol的测定结果显示，TGA得出的DoM与NMR或UV-vis法的结果高度吻合（差异小于1%）。最关键的是，对于无法用传统光谱方法定量的HA-Cyano，TGA成功地给出了其DoM为20.5%，首次实现了对该“沉默”修饰的量化。

3.5. 局限性与考量

研究也客观讨论了该方法的局限性。它特异地量化羧酸盐修饰，不适用于其他位点（如羟基）的修饰。方法的准确性依赖于最大限度地减少外来无机物的污染，并需精确控制pH调节引入的额外钠离子。此外，仪器的良好性能和严格校准也至关重要。

结论与展望

这项研究成功地开发并验证了一种基于热重分析残留物来量化大分子中羧酸盐修饰度的创新方法。该方法的核心优势在于其“修饰基团不可知”的特性——它不依赖于待测化学基团本身是否具有光谱活性，因此能够解决传统光谱技术无法应对的“沉默基团”的量化难题。实验证明，该方法对于多种不同化学结构的HA衍生物均能提供准确、可靠的结果，其精度可与标准光谱方法相媲美。除了高精度和普适性，该技术还具有无需标记、样品需求量少、可用于固态或凝胶状样品等优点，很好地弥补了现有分析技术的空白。虽然本研究以透明质酸为模型体系，但其原理适用于任何含有羧酸盐基团并能以钠盐形式存在的聚合物。这项工作为生物材料、高分子化学等领域的精确表征提供了一个强大、易于推广的新工具，对促进相关产品的质量控制、标准化以及新产品开发具有重要意义。