基于逆向反射Janus微球的非光谱多重分子诊断平台同步检测病原菌毒力与抗生素耐药基因

《Biosensors and Bioelectronics》：Non-spectroscopic multiplex molecular diagnosis for simultaneous detection of virulence and antibiotic resistance genes from pathogenic bacteria

抗生素滥用导致耐药菌株涌现，严重威胁公共卫生安全。为解决传统分子诊断技术依赖复杂仪器、难以现场应用的瓶颈，研究人员开发了集成环介导等温扩增（LAMP）与逆向反射Janus微球（RJP）光学检测的新型平台。该技术通过双标记引物设计实现沙门氏菌invA基因和四环素耐药tetA基因同步检测，检测限达0.59 CFU/反应，为食品供应链预筛查和临床现场检测提供了便携式解决方案。

　　

抗生素的广泛使用如同一把双刃剑，在治疗感染性疾病的同时，也加速了抗生素耐药菌株的进化与传播。这些耐药菌株往往通过质粒介导的基因水平转移，将耐药基因传递给原本敏感的细菌，使得常见抗生素逐渐失效。全球公共卫生系统正面临日益严峻的挑战，医疗成本持续攀升，治疗难度不断加大。在这一背景下，开发能够快速、准确识别病原菌及其耐药特性的诊断工具显得尤为重要。

传统检测方法如细菌培养和酶联免疫吸附试验虽然特异性高，但耗时长、操作繁琐，难以满足现场快速检测的需求。而基于聚合酶链反应（PCR）的分子诊断技术虽然灵敏度高，但依赖昂贵的热循环仪和复杂的光学检测设备，限制了其在资源有限地区的推广应用。

为了突破这些技术瓶颈，韩国明知大学的研究团队在《Biosensors and Bioelectronics》上发表了一项创新研究成果。他们成功开发了一种集成环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）和逆向反射Janus微球（Retroreflective Janus Microparticle, RJP）光学检测的新型诊断平台。该平台最大的创新点在于实现了非光谱式多重分子检测，仅需LED光源和普通相机即可完成信号读取，极大地简化了检测设备的要求。

研究人员采用的关键技术方法包括：改良的LAMP引物设计体系，通过在小分子抗原和生物素双标记引物引导下生成结构化扩增产物；微流控多通道检测芯片，支持同步检测多个遗传靶标；以及基于抗原-抗体特异性结合的RJP信号转导系统，实现非光谱光学检测。研究以食源性病原菌鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）为模型，同时检测其毒力基因invA和四环素耐药基因tetA。

材料和方法

研究团队对传统LAMP技术进行了重要改进。传统方法使用六种引物（FIP、BIP、F3、B3、LF、LB）进行扩增，但扩增速度难以控制，不适合多重定量检测。新设计的引物系统在LF引物末端引入荧光素异硫氰酸酯（FITC）或德州红（TR）等小分子抗原，在BIP引物引入生物素标记。这种设计使得扩增产物一端携带抗原决定簇，另一端结合生物素，形成适合夹心法检测的双标记DNA扩增子。

Primer design to generate double-labeled amplicon and optimize amplification efficiency

通过系统优化引物浓度、Bst DNA聚合酶用量、反应温度和时间等参数，研究人员成功平衡了invA和tetA两个靶基因的扩增效率。优化后的体系在65°C恒温条件下反应60分钟，可同步产生两种双标记扩增产物，为后续多重检测奠定基础。

结果与讨论

该平台展现出卓越的检测性能。对invA和tetA基因的检测限均达到0.59 CFU/反应（相当于196 CFU/mL），检测范围覆盖1-10⁴ CFU/反应（相当于3.3×10¹-3.3×10⁵ CFU/mL）。检测过程中，扩增产物通过抗原-抗体相互作用被特异性捕获在传感表面，随后与亲和素包被的RJP探针结合。当LED光源照射时，RJP的逆向反射特性产生强烈光学信号，仅需普通相机即可记录检测结果。

结论

本研究成功开发了一种创新的非光谱多重定量检测平台，通过整合LAMP扩增和逆向反射信号检测技术，实现了对细菌基因组DNA和质粒DNA的同步分析。该系统无需热循环仪或复杂光学设备，显著提高了分子诊断的可及性。研究人员成功对抗生素耐药性鼠伤寒沙门氏菌进行了高灵敏度、高选择性的定量检测，为食品供应链预筛查和疫情应对提供了强大工具。

该平台的模块化设计支持通过选择不同抗原-抗体对轻松扩展检测靶标数量，具备良好的适应性和可扩展性。特别值得一提的是，单一类型的RJP探针即可实现多重检测，大大简化了检测流程并降低了成本。这项技术为现场即时检测（Point-of-Care Testing, POCT）提供了新思路，在食品安全监测和临床感染诊断领域具有广阔应用前景。

研究团队通过创新性的技术整合，成功克服了传统分子诊断技术的多个局限性，为耐药菌感染的快速诊断和有效防控提供了有力工具。随着进一步优化和验证，这一平台有望成为遏制抗生素耐药性传播的重要技术支撑，为全球公共卫生安全作出积极贡献。