利用纳米孔RNA004测序技术解析人类癌症模型中的tRNA表达与修饰景观

《NAR Cancer》：Exploiting nanopore sequencing advances for tRNA sequencing of human cancer models

本研究针对传统tRNA测序方法存在的技术瓶颈，开发了基于牛津纳米孔RNA004化学技术的直接测序新方法。研究人员通过优化人类癌细胞系的tRNA文库构建流程，实现了对tRNA表达量和修饰状态的高通量检测。结果表明，该方法不仅将有效测序读数提升6倍，还能准确识别癌症相关tRNA修饰（如tRNAPhe的wybutosine修饰）。该技术为同时分析tRNA丰度与修饰提供了新工具，对癌症生物标志物发现具有重要意义。相关成果发表于《NAR Cancer》。

　　

在分子生物学的中心法则中，转移RNA（tRNA）作为蛋白质合成的关键适配器，其功能远不止是简单的"翻译员"。近年来研究发现，tRNA的动态变化能够通过重编程基因表达来帮助细胞应对环境变化和特定需求。特别是在癌症中，tRNA的表达谱和修饰状态会发生显著改变，这些变化通过调节富含增殖和转移相关基因的mRNA翻译，为肿瘤生长提供优势。

然而，由于tRNA具有稳定的二级结构和丰富的修饰位点（人类tRNA平均每个分子含有13种修饰），使得其测序一直面临巨大挑战。传统的下一代测序方法依赖逆转录和PCR扩增，会导致高度修饰tRNA的测序偏差，且在去除修饰的过程中会丢失关键信息。虽然牛津纳米孔技术的直接RNA测序平台为这些问题提供了潜在解决方案，但之前的RNA002化学技术在人类tRNA测序中仍存在输出量低和映射质量差的问题。

荷兰癌症研究所的Adva Kochavi、Arno Velds等研究人员在《NAR Cancer》上发表的最新研究，系统评估了纳米孔新技术RNA004化学在人类癌症模型tRNA测序中的应用。他们发现，这一技术不仅能更准确地量化tRNA表达，还能同时检测多种修饰状态，为全面解析人类tRNA组提供了有力工具。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先优化了基于RNA004化学的tRNA文库制备流程，包括适配体连接和cDNA合成步骤；使用Dorado碱基识别器进行实时信号解码和修饰识别；通过BWA-MEM算法比对读数至人类tRNA参考序列，并开发了改进的映射质量评估方法；利用基识别错误率分析和修饰概率计算两种策略检测tRNA修饰；通过蛋白质印迹和液相色谱-质谱联用技术验证关键发现。

改进的RNA004化学技术显著提升tRNA检测效率

研究团队首先比较了RNA002和RNA004两种化学技术在tRNA测序中的性能。结果显示，RNA004技术不仅将映射读数数量提高了6.4倍，还将正确映射读数的比例从34.5%提升至74.6%，同时将反义映射减少了6.6倍。更重要的是，RNA004技术在两个测试的细胞系（A375和SK-MEL-28）中显示出更高的重复性相关性（从0.858-0.896提升至0.982-0.996）。此外，研究人员还发现，在RNA004测序中，逆转录步骤对结果影响不大，这进一步简化了工作流程。

识别tRNA反密码子池中的表达差异

利用RNA004 tRNA测序技术，研究人员检测了不同癌细胞系中tRNA同工受体的表达水平。虽然总体上tRNA表达模式在不同细胞系间相似，但主成分分析和Z-score分析揭示了各细胞系特有的tRNA表达谱。此外，研究还发现，在依托泊苷处理条件下，SLFN11表达细胞中II型tRNA（特别是tRNA^Leu(TAA)）显著下调；而在精氨酸剥夺条件下，仅tRNA^Arg(TCT)特异性减少。这些发现通过qRT-PCR得到了验证，表明RNA004 tRNA测序能灵敏检测应激条件下的tRNA变化。

通过基识别错误率推断tRNA修饰

研究团队首先采用基识别错误率分析策略检测tRNA修饰。以研究较为深入的tRNA^Phe(GAA)为例，该方法成功注释了17个已知修饰位点中的13个，包括与癌症相关的wybutosine（yW）修饰。值得注意的是，yW修饰在位置37的错误率与TYW2（yW合成关键酶）表达水平呈正相关。通过TYW2敲除和过表达实验，研究人员进一步证实了这种关联性，并通过LC-MS shotgun分析验证了yW衍生物的变化。然而，该方法对某些修饰（如二氢尿苷和5-甲基胞苷）的检测效果有限，且无法检测URM1介导的tRNA硫醇化修饰。

利用信号分析预测常见tRNA修饰

研究团队还评估了Dorado基识别器的新修饰识别功能，该功能基于原始信号直接计算修饰概率。针对m5C修饰的分析显示，RNA004 tRNA测序能以>10%的概率阈值识别约90%的UBS-seq（超快速亚硫酸氢盐测序）已报道位点。该方法成功检测到tRNA保守位置48-50的高甲基化率，以及位置38和72的特定tRNA甲基化模式。类似地，对假尿苷（Ψ）的分析也显示，RNA004能识别保守位点和高置信度的tRNA特异性修饰位点。然而，研究也发现该方法存在局限性，如难以区分m5C和m3C、m6A和m1A等同分异构修饰，且可能产生假阳性信号。

0%,>10%, and>20%) and BACS[27].(C) Heat maps showing average modification rate(%) of Ψ sites identified by RNA004 tRNA-seq with a minimum threshold of 10%(upper panel) and BACS(lower panel).'>

本研究系统评估了纳米孔RNA004化学技术在人类癌症模型tRNA测序中的应用价值。该技术不仅显著提高了tRNA测序的效率和准确性，还实现了对tRNA表达量和修饰状态的同步分析。研究人员开发的改进映射质量评估方法和两种修饰检测策略，为全面解析人类tRNA组提供了重要工具。

研究结果表明，RNA004 tRNA测序能灵敏检测癌细胞系间的tRNA表达差异以及应激条件下的特异性tRNA变化。通过基识别错误率分析，研究人员成功注释了tRNA^Phe的多个修饰位点，并证实了yW修饰与TYW2表达的相关性。而Dorado修饰识别功能则显示出检测常见tRNA修饰（如m5C和Ψ）的潜力，尽管在区分同分异构修饰方面仍存在局限。

该研究的创新点在于首次将RNA004化学技术优化应用于人类tRNA测序，解决了传统方法的技术瓶颈。然而，修饰检测的准确性和特异性仍需通过酶敲除、LC-MS/MS和正交方法进一步验证。未来随着纳米孔技术的不断发展，该方法有望在癌症诊断、治疗反应预测和生物标志物发现中发挥重要作用，推动tRNA生物学和癌症表观转录组学的研究进展。