综述：利用纳米抗体的独特性质：增强治疗、药物递送和靶向诊断

《Drug Discovery Today》：Exploiting the unique properties of nanobodies: enhancing therapeutics, drug delivery, and targeted diagnostics

这篇综述系统阐述了纳米抗体（Nbs）的起源、独特优势及其在生物医学领域的广泛应用。文章重点介绍了Nbs相较于传统单克隆抗体（mAbs）的小尺寸（~15 kDa）、高稳定性、强组织穿透性以及易于工程化（如构建双特异性/多价Nbs）等特点，并详述了其在结构生物学（如稳定GPCR构象）、体外诊断（如侧向流动分析LFA）、体内成像（如PET/SPECT）以及疾病治疗（如癌症、感染、神经退行性疾病）中的前沿进展。最后，综述还概述了已获批的Nbs药物（如caplacizumab）和临床在研管线，展望了其巨大潜力。

　　

重链抗体：纳米抗体的来源

在1993年之前，重链抗体（HcAbs）仅在人类和小鼠中罕见的重链沉积病背景下为人所知，这种疾病中不伴随轻链的重链沉积常导致肾衰竭。1993年，研究人员在骆驼科动物中发现了天然存在的HcAbs。这类特殊的免疫球蛋白G（IgG）抗体仅由两条重链组成，缺少第一个恒定重链结构域（CH1）。而在传统IgG中，CH1与恒定轻链结构域（CL）结合，为抗体的正确组装提供结构锚点。

随后的研究发现，骆驼IgG2a的编码基因实际上包含CH1区域，但一个单核苷酸替换（GT变为AT）消除了剪接共识信号，导致CH1区域从mRNA中被移除，从而产生了缺乏CH1的HcAbs。这与人和鼠的重链病不同，后者通常存在大片段的缺失，去除了整个CH1域，甚至常常还包括部分可变区，导致产生截短且易于聚集的HcAbs，同时也丧失了正确识别抗原的能力。

在天然存在的HcAbs中，框架区2（FR2）中的四个氨基酸替换通过将重链可变区（VH）原先的可变区轻链（VL）结合界面重塑为更亲水的表面，来抵消这些缺陷。这提高了仅重链抗体可变区（VHH）在水溶液中的溶解度，并避免了病理性HcAbs典型的聚集倾向。

传统抗体通过VH-VL组合配对和体细胞突变来贡献多样性。HcAbs缺乏轻链（以及VL区），因此人们曾预期其抗原结合库会比异源四聚体（H₂L₂）抗体受到严重限制。然而，研究发现VHHs内部具有很高的抗原结合多样性。VHHs自身保留了完整的抗原结合能力，可以作为所谓的“纳米抗体（Nbs）”被重组表达。“Nb”一词由Ablynx公司在2003年作为商标引入，但由于其名称恰当地反映了该抗体片段约15 kDa的小尺寸，该术语现在被普遍用于指代基因工程化的VHHs。随着2013年Ablynx公司主要专利权利要求到期，Nbs在治疗、诊断和研究中的应用兴趣日益增长。

纳米抗体及其独特优势

在许多情况下，Nbs是传统单克隆抗体（mAbs）的等效替代品。尽管尺寸更小，但其固有的靶标结合亲和力和特异性与mAbs的VH-VL结构域相似。一个原因可能是其互补决定区（CDRs）环更长，提供了足够的抗原接触表面，补偿了结合位点尺寸的减小。然而，由于mAbs是双价的，亲和力效应通常导致mAbs的整体结合强度高于单价Nbs。

更重要的是，Nbs相比mAbs具有某些优势，从而催生了新的应用。FR2中氨基酸的亲水性替换阻止了与轻链的相互作用，同时有助于提高Nbs的溶解度。加上其改善的温度稳定性、抗蛋白酶降解能力以及对不利pH条件的耐受性，Nbs比传统mAbs更易于处理和储存。VHH结构域固有的高溶解度使其不依赖于糖基化等翻译后修饰来实现正确折叠和功能，这简化了其重组生产。尽管保守的二硫键存在且对稳定性至关重要，但Nbs通常在没有它的情况下也能发挥功能（例如在细胞质中）。此外，Nbs相比传统mAbs具有固有的较低免疫原性风险。这很可能反映了VHH与人类V区，特别是VH3家族的高序列同源性。当然，也存在对Nbs进行人源化以进一步降低其在人体中潜在免疫原性的方法。

此外，尽管mAbs和Nbs的结合位点可能重叠，但许多VHHs也能结合mAbs结合位点无法接近的表位。这种卓越的可及性源于两个主要因素：VHHs尺寸小，缺乏大的VH-VL配对表面和CLs，使它们能够深入部分覆盖或高度凹陷的表位。其次，常规IgGs的刚性更强，阻止了它们接触部分覆盖的表位。

而且，Nbs可以通过基因工程以模块化方式组合，实现多特异性和多价性。双特异性mAb或单链可变片段（scFv）构建体常见的挑战，例如在细菌表达系统中表达量低和形成功能失调的同源二聚体，在Nb构建体中可以得到减少。Nbs在多模式构建体中保持其结合特性。然而，随着寡聚化程度的增加，表达产量最终会下降。

Nbs的低分子量也在许多应用中带来了有利的药代动力学特性。由于细胞内的扩散速率与分子大小成反比，Nbs较低的分子量使其具有改善的组织穿透能力。此外，Nbs及其许多小分子偶联物（如放射性标记的Nbs）低于50-60 kDa的肾滤过阈值，意味着它们会被快速清除，限制了全身暴露，从而降低了偶联剂产生毒性效应的可能性。然而，Nbs的循环时间短既是优势也是劣势，这取决于具体应用。例如，在成像应用中需要快速清除，而血清半衰期缩短会限制其生物利用度，从而影响治疗性Nbs的疗效。

工程化纳米抗体的生成：从动物免疫到理性计算设计

生成Nb库和鉴定合适结合体的可用方法此前已有详细综述。传统上，Nb库是通过免疫骆驼科动物产生的，这是一种成熟的方法，受益于体内的亲和力成熟，能产生高度多样性的库。作为一种低成本的替代方案，转基因小鼠（如携带美洲驼Ig重链基因座的“LamaMouse”）已被开发出来。这些小鼠只产生HcAbs，生成聚焦的Nb库，而不会受到传统抗体的干扰。

为了减少动物使用并应对某些不适合体内免疫的靶标（如非免疫原性靶标），合成库被开发出来。合成Nb库通常建立在稳定且非免疫原性的框架区支架上，并在CDRs区进行多样化，可以是随机的，也可以基于天然VHH序列统计。此类库的变体数量可达约10⁹，产生的Nbs与动物免疫获得的相当。它们的主要限制是缺乏体内亲和力成熟，这部分地被巨大的库容量所抵消。合成方法在免疫无效的情况下尤其有优势。例如，Zimmermann等人开发的sybodies，是旨在稳定膜蛋白特定构象的合成Nbs。

从免疫库中筛选通常能在1-2周内产生高亲和力结合物，而从现有合成库中筛选也可在相似时间内完成，但从头生成合成库仍然耗时。为了解决这个限制，基于机器学习（ML）的策略正在被应用。例如，NanoAbLLaMA利用蛋白质大语言模型生成受种系条件约束的Nb序列。尽管该框架证明了ML可以加速合成库设计，但仍有待实验验证。在此背景下，诸如NBBench等纳米抗体特异性ML模型的基准测试工具，对于此类合成库生成策略所依赖的计算模型的比较评估可能很有价值。

除了库生成之外，计算工具也被应用于理性的Nb设计和优化。基于深度学习的框架，如RFdiffusion，已经能够从头设计靶向预定表位的Nbs，其精度达到原子水平，并可通过定向进化系统（如OrthoRep）进行实验优化。对于筛选后的优化，包括AbNatiV在内的工具可以评估“天然性”，并指导自动化人源化，以最小化免疫原性，同时保留抗原结合能力和稳定性。

总之，这些发展展示了Nbs从经典免疫到合成和计算策略的扩展。合成库提供了无动物替代方案，但仍需要实验成熟，而用于从头设计和筛选后优化的计算方法是有价值的补充，尽管广泛的验证对于临床转化是必要的。

纳米抗体的应用

研究工具

Nbs可用于多种研究应用。由于其能够将蛋白质固定在特定构象状态，它们越来越多地被用作结构蛋白质研究（包括晶体学研究）中的辅助蛋白。

鉴于蛋白质是高度动态的，获得足够质量的晶体用于衍射研究是一个主要挑战。虽然抗体片段（Fabs）作为结晶伴侣有着良好的记录，但在某些情况下，Nb伴侣特别有用。大多数已解析的G蛋白偶联受体（GPCRs）结构对应于最稳定的受体构象，即非活性状态。然而，对于这些膜受体的机理研究，解析活性状态和中间构象至关重要。Rasmussen等人的里程碑研究中，使用一种作为激动剂的Nb，解析了第一个高分辨率的活性、激动剂结合的GPCR（β₂肾上腺素能受体）结构。通过结合狭窄的细胞内口袋（体积较大的Fab片段无法进入），Nbs可以稳定瞬时的受体构象，从而能够解析复合物的活性状态。这一原理不仅限于GPCRs。

除了晶体学，Nbs在单颗粒冷冻电子显微镜（cryo-EM）中也已被证明是宝贵的工具，有助于解决该技术的一些挑战。一个主要障碍是确定小蛋白质（小于约100 kDa）的结构，这需要增加目标蛋白分子量而不改变其结构的策略。Uchánski等人通过使用Nbs作为megabodies的一部分来解决这个问题：megabodies是Nbs（或monobodies）与更大的刚性蛋白质支架的模块化嵌合构建体。这些支架增加了颗粒大小，同时保留了Nb对靶标的结合特异性。尽管存在增加颗粒大小的替代策略，但megabodies被证明在防止许多靶标（尤其是膜蛋白）在气-水界面观察到的优先取向方面特别有用。在类似的方法中，Bloch等人开发了NabFabs，它们是结合Nbs保守特征的合成Fabs，作为cryo-EM的刚性基准标记。与需要靶标特异性融合设计的megabodies相比，NabFabs可以结合多个携带保守结合位点的纳米抗体，使该方法更快、更模块化。更进一步，Legobodies是一种“乐高式”模块化组装，其中一个Fab结合一个Nb，另一个蛋白质桥接这两个组件，同时进一步增加颗粒质量和刚性。

另一个应用是使用Nbs作为ELISA和其他生物传感平台中的抗原捕获剂。它们的小型单体结构允许密集且定向的表面固定，提高了抗原捕获效率。此外，其高耐热性和耐化学性使其能够在更苛刻的表面再生条件下保持活性。Klooster等人表明，基于Nb的捕获剂在从血液中去除IgG方面比标准的Protein A方法更有效。而且，许多Nbs在活细胞和还原性细胞质内仍能保持功能，这对于免疫调节目的特别有用。Kirchhofer等人通过Nb结合诱导的构象变化，能够降低或提高活细胞中GFP的荧光强度。此外，通过将Nb与荧光蛋白融合，可以生成基于Nb的细胞内示踪剂。这些称为chromobodies的融合构建体可以轻松在活细胞中表达，以靶向和追踪内源性蛋白质。

Nbs作为超分辨率显微镜的探针正受到越来越多的关注，因为它们的小尺寸减小了荧光团与靶向表位之间的距离，从而提高了成像分辨率。靶向GFP的Nbs也可用于研究体内蛋白质-蛋白质相互作用。Herce等人开发了一种所谓的“荧光三杂交策略”，其中抗GFP Nb附着在特定的亚细胞区室，而两个感兴趣的蛋白质分别用GFP或RFP标记。GFP标记的蛋白质被Nb捕获并限制在其位置。当蛋白质相互作用时，可以观察到GFP和RFP的共定位，从而能够在体内研究蛋白质相互作用。

细胞内稳定的Nbs特别适合于基因编码策略来操纵细胞内靶标，例如光开关Nbs（称为“OptoNBs”）的开发，其中Nb与光敏结构域融合。在光照下，OptoNBs发生构象变化，可逆地改变其与未标记靶蛋白的结合亲和力。通过选择激活性或抑制性Nbs，可以可逆地开启或关闭内源性信号通路，实现具有时空控制的功能研究，而无需永久性修饰或敲除靶标。类似地，Tang等人最近将光诱导的Nb结合与靶向蛋白质降解相结合，将光遗传学Nbs扩展到动态控制蛋白质水平。除了光遗传学控制，Nbs也可以进行化学遗传学控制，例如Farrants等人展示的方法。在这里，临床批准的小分子药物甲氧苄啶影响Nb与GFP标记蛋白的结合亲和力，为OptoNBs提供了一种替代方案，其时空控制精度较低，但更适用于全身性和潜在的体内应用（在这些应用中光递送受限）。

Nbs的稳定性、小尺寸和构象特异性的独特结合使其成为研究中的多功能工具。它们稳定动态蛋白质状态用于结构研究，如晶体学和cryo-EM，它们在细胞内发挥作用的能力使其能够用于细胞内成像或调节蛋白质活性。在基于表面的分析中，它们直接的定向固定化改善了抗原捕获和灵敏度。总的来说，这些特性将Nb的研究应用扩展到了传统抗体之外。

诊断工具

Nbs已被探索作为多种病原体感染的体外诊断工具，例如病毒、细菌和寄生虫感染。

Nbs特别适用于基于红细胞（RBC）的诊断，其模块化和与抗原基因融合的兼容性使得易于适应凝集试验。Habib等人通过分离一个红细胞结合Nb（IH4）并将其与HIV p24抗原融合，证明了这一点，通过Nb介导的红细胞凝集实现诊断。同一个Nb后来通过将其与病毒的受体结合域（RBD）融合，被重新用于诊断SARS-CoV-2，导致感染患者血液中的红细胞凝集。IH4-RBD融合构建体随后被用于现场血凝试验方案，以量化SARS-CoV-2抗体水平，展示了Nbs在即时检测环境中的潜力。在这里，该构建体的低生产成本、稳定性和快速适应新病毒变体的能力使其特别适合偏远和资源有限地区。

在SARS-CoV-2诊断开发中，已经开发了使用Nbs的侧向流动分析（LFA）。尽管LFA与实验室检测（如PCR）相比灵敏度较低，但它们对于大规模、低成本检测非常重要。通常，LFA基于传统抗体，但Maher等人证明使用Nbs可以提高其灵敏度和特异性。基于Nb的LFA也在为其他传染病开发，包括中东呼吸综合征和寨卡病毒。

除了这些经典形式，Nbs也被整合到更先进的生物传感平台中。Guo等人开发了一种功能化Nbs的有机电化学晶体管，可以在唾液和血清中快速检测病毒抗原，具有单分子灵敏度。在该设计中，Nbs与SpyCatcher基因融合，后者共价结合固定在金栅电极上的SpyTag肽，创建了一个密集、均匀定向的功能性Nbs层用于抗原检测。此外，该系统的模块化性质允许通过交换Nb轻松适应其他诊断靶标。类似地，Pandey等人开发了另一种高灵敏度的基于Nb的电化学传感器，用于检测可溶性细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4），这是癌症诊断、预后和患者分层的重要标志物。

Nbs特别适合这些类型的传感器，因为它们的特性能够实现高密度、定向固定化，而这对于传统抗体来说不易实现。在这里，密集的表面固定化可能导致空间位阻，降低其活性，并且控制取向的策略通常更为复杂。

与传统抗体和更小的Fabs（后者常受不稳定性、聚集和低产量困扰）相比，Nbs作为体内成像应用（如正电子发射断层扫描（PET）或单光子发射计算机断层扫描（SPECT）成像）的示踪剂呈现出有前景的替代方案。它们的小尺寸使得能够快速从血管中外渗并更容易地穿透组织。此外，未结合的放射性标记Nbs的快速肾脏清除能迅速降低背景信号，允许在示踪剂注射后早至1小时即可获得高质量图像和良好的信噪比。这种快速清除也允许使用短半衰期放射性核素，为患者提供更安全的诊断程序。

基于Nb的示踪剂已经进入临床研究。在一项I期研究中，Keyaerts等人评估了一种⁶⁸Ga标记的抗人表皮生长因子受体2（HER2）Nb用于PET成像和患者分层，结果令人鼓舞。类似地，Zhao等人在一项I期研究中评估了一种^99mTc标记的抗HER2 Nb，结果显示示踪剂摄取与HER2表达水平成正比（通过新诊断乳腺癌患者的免疫组织化学确定）。该示踪剂能够可视化异质性受体分布，且在非肿瘤炎症组织中无摄取。

除了HER2，Ma等人开发并临床测试了一种¹⁸F标记的Nb，用于非小细胞肺癌（NSCLC）中程序性死亡配体1（PD-L1）的PET成像，这是一项首次人体试验。快速的血液清除允许在注射后2小时内获得高对比度图像，而传统示踪剂需要4-7天，揭示了PD-L1表达的空间异质性。另一种靶向NSCLC中PD-L1并用^99mTc标记的Nb正在进入SPECT成像的II期研究（NCT04992715）。PD-L1导向的Nb示踪剂的快速临床进展最近还获得了一项专利的强调，该专利涉及使用放射性标记的抗PD-L1 Nb对原发性和转移性肿瘤进行成像，凸显了该方法的商业兴趣。

基于Nb的放射性示踪剂的一个显著局限性是经常观察到的高程度肾脏Nb积累，这使得肾脏邻近组织的分析复杂化。最近减少肾脏滞留的方法包括PEG化，尽管这可能导致肿瘤摄取减少。在一项比较研究中，Olkowski等人分析了放射性标记化学的不同优化策略对Nb放射性示踪剂的影响，表明基于[¹⁸F]-氟吡啶的 prosthetic groups 显著降低了肾脏信号而不影响肿瘤摄取。基于Nb的示踪剂前景广阔，特别是对于肾脏邻近区域以外的肿瘤。然而，示踪剂和优化策略的选择仍需根据具体情况决定。

除了核成像，Nbs还支持其他模式。例如，Ding等人设计了一种靶向CDH17并与近红外荧光染料偶联的Nb，可用于结直肠肿瘤的术中成像。Chen等人提供了一个多模式例子，他们设计了靶向Nb的纳米气泡，用于肾细胞癌（RCC）的超声、光声和荧光成像。在这里，针对RCC膜抗原G250的Nb被偶联到携带吲哚菁绿的纳米气泡表面。

总之，Nbs能够对HER2和PD-L1等靶点进行快速、高对比度的体内PET和SPECT成像，与传统抗体相比具有改进的时空分辨率。尽管肾脏积累仍然是基于Nb的放射性示踪剂的一个限制，但正在研究优化策略以减轻这一问题。Nbs也支持替代模式，突出了其在体内诊断方面的多功能性。

治疗工具

治疗性和体内诊断应用的一个关键区别在于，治疗剂必须达到足以产生治疗效果的目标浓度。此外，治疗需要作用于许多（如果不是全部）靶分子，这与成像不同（例如，成像只关心分子在不同位置的相对丰度）。Nbs增强的外渗能力和更深的组织穿透能力使其能够进入血管化不良的组织。然而，这种优势是以血液循环时间短为代价的，通常需要施用高剂量才能在靶点达到有效的Nb浓度。存在几种策略来解决这一挑战，例如与片段可结晶区（Fc）结构域融合（当需要时也恢复Fc效应功能）、聚乙二醇（PEG）或血清白蛋白结合构建体。虽然这些延长了循环时间，但不可避免地增加了尺寸，从而部分抵消了Nbs的固有优势。

癌症治疗中的治疗性纳米抗体

改善肿瘤穿透和均匀分布

基于mAbs或抗体药物偶联物（ADCs）的靶向癌症疗法常因肿瘤穿透差和分布不均匀而受限，特别是在血管缺陷的缺氧区域，这导致治疗失败和耐药性。相比之下，Nbs显示出改善的瘤内分布。在异种移植小鼠模型中，Debie等人报告称，荧光标记的抗HER2 Nbs比曲妥珠单抗分布更均匀，后者被截留在外部肿瘤细胞层。虽然曲妥珠单抗的总体摄取更高，但单体Nbs到达肿瘤更快，分布更均匀。二聚体Nb构建体实现了更长的循环时间和更均匀的肿瘤分布，但由于尺寸增加，失去了一些穿透能力。因此，需要进一步的策略来延长Nb循环，使其能够更渐进地在瘤内积累，同时保持其小尺寸及相关优势。

一种成功的方法是将Nb基因融合到白蛋白结合域（ABD）。与白蛋白的非共价结合通过增加构建体在血液中的尺寸来防止快速肾脏清除，同时允许Nb在穿透肿瘤时从白蛋白上解离，在需要的地方保留其小尺寸优势。将ABD与靶向HER2的Nb融合，实现了近15倍的循环时间延长，且不干扰均匀分布，在小鼠中产生了强大的抗肿瘤效果。因此，Nbs的模块化工程可以同时实现长暴露时间，同时保留深部组织穿透能力。

实现免疫检查点阻断的局部递送

免疫检查点抑制剂（ICIs），靶向CTLA-4或PD-L1，效力强大，但常引起不必要的免疫原性和全身毒性。Nbs实现了一种局部生产策略，这对于全长抗体是不可行的。工程化的肿瘤定植益生菌被设计用于在肿瘤部位选择性产生和释放抗PD-L1和抗CTLA-4 Nbs，在小鼠中诱导肿瘤消退，同时限制全身暴露。联合ICI疗法通常具有更强的抗肿瘤效果，但使用传统ICIs时可能导致更严重的毒性不良反应，因此局部递送ICI的相关性显得尤为重要。

穿透血脑屏障和治疗脑部病变

使用Nbs靶向脑肿瘤或转移瘤也显得很有前景。较小的Nbs具有改善的穿过血脑屏障（BBB）的能力。尽管一些研究中发现其浓度低于治疗水平，但也有成功的报道。在一项临床前小鼠研究中，抗HER2 Nb-放射性偶联物在HER2⁺脑部病变中显示出高摄取，并伴随生存期延长。更近期的受体介导的转胞吞作用工程（转铁蛋白受体（TfR）结合Nbs或pH敏感性TfR Nbs）改善了治疗性mAbs等大分子向大脑的递送。这种方法得益于Nbs的小尺寸和易于模块化融合到治疗性 cargoes 上。

需要纳米抗体模块化的多价/工程化平台

在某些情况下，单一的Nbs可能不足以产生治疗效果，需要更高密度的Nb结合。功能化多个抗表皮生长因子