光遗传学筛选发现TopBP1生物分子凝聚体抑制剂：为癌症治疗提供新策略

《NAR Cancer》：Shining light on drug discovery: optogenetic screening for TopBP1 biomolecular condensate inhibitors

本研究针对ATR抑制剂在癌症治疗中存在的毒性和耐药性问题，创新性地聚焦于TopBP1生物分子凝聚体这一新型靶点。研究人员开发了高通量光遗传学筛选平台，从1520种FDA批准药物中鉴定出奎纳克林(quinacrine)和硫柳汞(thimerosal)能有效抑制TopBP1凝聚体形成，阻断ATR/Chk1信号通路激活。重要的是，奎纳克林通过改变染色质可及性影响TopBP1与染色质结合，并与FOLFIRI方案(5-FU+伊立替康)协同抑制结直肠癌模型生长，为改善化疗疗效提供了新思路。

　　

每天，细胞都要面对成千上万的DNA损伤，这些损伤可能来自内部代谢产物，也可能来自外部环境因素。而对于癌细胞来说，由于其混乱的代谢和快速增殖的特性，它们承受的基因毒性压力远高于正常细胞。为了应对这种持续存在的威胁，细胞演化出了一套精细的DNA损伤应答(DNA Damage Response, DDR)机制，能够检测、信号传导并修复DNA损伤，同时协调DNA复制、转录等重要细胞过程。

在癌症治疗领域，除了传统的放疗和化疗等直接诱导DNA损伤的方法外，针对DNA损伤信号和修复机制的新型治疗策略正在兴起。其中，ATR(Ataxia Telangiectasia and Rad3-related)信号通路因其在细胞周期检查点激活、DNA修复、复制调控等方面的核心作用而备受关注。由于ATR能够让癌细胞在高压的基因毒性环境下继续增殖，针对它的抑制剂目前正在临床试验中进行评估。然而，激酶抑制剂通常毒性较大，且容易通过突变产生耐药性，这就需要我们寻找替代的治疗策略。

那么，是否存在一种更为精准的方式来调控ATR信号，从而规避传统抑制剂的局限性呢？答案可能隐藏在一个名为TopBP1(Topoisomerase IIβ binding protein 1)的支架蛋白中。TopBP1通过其内在无序的ATR激活结构域，在细胞周期S期作为主要的ATR激活剂发挥作用。更重要的是，研究人员最近发现TopBP1是通过形成生物分子凝聚体(biomolecular condensates)来激活ATR信号通路的——这些无膜的特殊细胞区室能够浓缩蛋白质和核酸，像分子开关一样将ATR活性放大到足以激活下游检查点效应激酶Chk1的水平。

与传统靶向特定蛋白的小分子抑制剂不同，靶向生物分子凝聚体为药物研发提供了新思路。由于凝聚体的形成依赖于多价蛋白支架(如TopBP1)的相互作用，干扰这些关键的蛋白质-蛋白质或蛋白质-核酸相互作用，就可能改变凝聚体的性质和功能。

在这项发表于《NAR Cancer》的研究中，研究人员正是基于这一理念，利用先前建立的高通量光遗传学筛选平台，从1520种FDA已批准药物中寻找能够调节TopBP1凝聚体形成的化合物，并深入探索其作用机制和治疗潜力。

研究人员主要运用了以下几项关键技术：建立了基于光遗传学(optogenetics)的高通量筛选系统，通过蓝光诱导TopBP1-Cry2融合蛋白形成凝聚体；利用高内涵成像技术自动量化药物处理后的凝聚体变化；通过细胞核提取物实验在无细胞体系中验证化合物对ATR/Chk1信号通路的直接影响；采用细胞分级分离技术分析TopBP1与染色质的结合状态；结合2D细胞培养、3D肿瘤球体模型和小鼠腹膜癌转移模型，全面评估药物单用或与FOLFIRI化疗方案联用的抗肿瘤效果。

光遗传学筛选鉴定TopBP1凝聚体抑制剂

研究人员首先利用表达TopBP1-Cry2-mCherry融合蛋白的HEK293细胞系，建立了一套高效的光遗传学筛选平台。当暴露于488纳米蓝光时，Cry2会发生四聚化，进而触发TopBP1凝聚体的形成。这种方法的优势在于能够在几分钟内按需诱导凝聚体，而无需使用可能引起复杂效应的DNA损伤剂。

通过对Prestwick化合物库(包含1520种FDA批准药物)的筛选，研究人员发现了31个潜在的TopBP1凝聚体调节剂。特别值得注意的是，其中约半数的活性化合物属于DNA嵌入剂或DNA结合分子，包括奎纳克林、硫柳汞、甲苯胺蓝等。这一发现提示，染色质表面可能为TopBP1等核支架蛋白的凝聚提供了平台，而DNA结合类药物则可能通过改变染色质结构来干扰凝聚过程。

奎纳克林和硫柳汞抑制内源性TopBP1凝聚体形成

为了验证筛选结果，研究人员在结直肠癌HCT116细胞中检验了奎纳克林和硫柳汞对SN-38(伊立替康活性代谢物)诱导的内源性TopBP1凝聚体的影响。免疫荧光结果显示，这两种化合物均能显著减少SN-38诱导的TopBP1核焦点数量。重要的是，这种抑制作用具有特异性——奎纳克林并不影响PML核体等其他生物分子凝聚体的形成。在SN-38耐药的HCT116-SN50细胞中，奎纳克林同样能够降低基础水平的TopBP1焦点数，但对有丝分裂期的TopBP1凝聚体没有影响，表明其作用具有复制应激特异性。

奎纳克林和硫柳汞抑制ATR/Chk1信号通路激活

由于TopBP1凝聚体是ATR信号放大的关键开关，研究人员进一步探讨了这两种化合物对ATR/Chk1通路的影响。在无细胞体系中，奎纳克林和硫柳汞均能浓度依赖性地抑制Chk1 Ser345位点的磷酸化，表明它们直接干扰了ATR的激活过程。

在活细胞中，通过Celigo成像细胞仪和高通量免疫荧光分析，研究人员证实奎纳克林和硫柳汞能够剂量依赖性地抑制SN-38诱导的Chk1磷酸化。Western blot结果进一步显示，这两种化合物还抑制了RPA32 Ser33位点的磷酸化(pRPA)。值得注意的是，只有奎纳克林显著降低了H2AX Ser139位点的磷酸化(γH2AX)，提示二者可能通过不完全相同的机制影响TopBP1凝聚体和DNA损伤应答。

奎纳克林影响TopBP1在染色质上的招募

为了阐明奎纳克林的作用机制，研究人员通过细胞分级分离实验发现，奎纳克林处理增加了TopBP1在可溶核质组分中的分布，同时减少了其在染色质组分中的含量，表明奎纳克林干扰了TopBP1与染色质的稳定结合。进一步分析组蛋白修饰状态发现，奎纳克林显著降低了与开放染色质相关的H3K9乙酰化(H3K9Ac)水平，而不影响H3K4me3或H3K9me3修饰。这提示奎纳克林可能通过促进染色质压缩，降低了其可及性，从而妨碍了TopBP1的招募和滞留。

奎纳克林与化疗药物的协同作用

接下来，研究人员评估了奎纳克林与FOLFIRI方案(包含5-FU和伊立替康)的相互作用。通过全浓度矩阵分析，发现在HCT116和CT26结直肠癌细胞系中，奎纳克林与FOLFIRI联合主要表现出相加作用，并在3D肿瘤球体模型中显示出明显的协同效应。在SN-38耐药细胞系中，这种相加/协同作用同样存在。细胞死亡分析表明，该联合方案在HCT116细胞中主要起细胞静止作用，而在CT26细胞中则表现出细胞毒性。

奎纳克林增强FOLFIRI的体内抗肿瘤效果

最后，研究人员在小鼠腹膜癌转移模型中评估了奎纳克林联合FOLFIRI的治疗效果。结果显示，与单用FOLFIRI相比，联合治疗显著抑制了肿瘤生长，降低了腹膜癌指数(PCI)，并提高了完全缓解率(5/6 vs 3/6)。肿瘤组织分析发现，联合治疗组Chk1磷酸化水平降低，而γH2AX信号维持在高位，提示在奎纳克林存在下，DNA损伤信号得以维持而检查点激活被抑制，这可能是协同作用的重要机制。

这项研究不仅验证了靶向生物分子凝聚体作为癌症治疗新策略的可行性，还揭示了奎纳克林这一老药的新作用机制——通过改变染色质状态干扰TopBP1凝聚体形成，进而抑制ATR/Chk1信号通路。这种机制与传统的DNA损伤诱导剂或激酶抑制剂有所不同，可能为克服现有治疗的毒性和耐药性问题提供新途径。更重要的是，奎纳克林与FOLFIRI方案的协同作用，尤其是在耐药模型中的效果，为改善晚期结直肠癌的治疗结局带来了希望。这项研究为生物分子凝聚体靶向治疗的发展奠定了重要基础，开辟了癌症治疗的新方向。