巨噬细胞外泌体介导聚乙烯微塑料转运至髓核细胞并通过NAT10/SLC7A11轴及ac4C修饰促进椎间盘退变的机制研究

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Polyethylene microplastics transported to nucleus pulposus cells via macrophages-derived exosomes, and promote intervertebral disc degeneration through NAT10/SLC7A11 and ac4C modification

本研究针对椎间盘退变（IVDD）这一导致腰背痛的主要病理基础，探讨了环境污染物聚乙烯微塑料（PE-MPs）的新型致病机制。研究人员发现PE-MPs可被巨噬细胞摄取并经由其衍生的外泌体（M0-MPs-exo）转运至髓核细胞（NPCs），通过下调NAT10/SLC7A11/GPX4通路、增强ac4C RNA修饰、诱发铁死亡（ferroptosis）和细胞衰老，最终加剧IVDD。体内外实验证实，过表达NAT10或联用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1能有效逆转上述退变表型。该研究首次揭示了PE-MPs通过外泌体跨细胞运输及表观转录组修饰参与IVDD的分子网络，为开发靶向干预策略提供了新靶点。

　　

腰背痛是一个全球性的重大健康挑战，导致显著的残疾和社会经济负担。其主要的病理基础是椎间盘退变（IVDD）。椎间盘是一个复杂的结构，由髓核（NP）、纤维环（AF）和软骨终板（CEP）组成，共同维持脊柱的生物力学功能。IVDD的发病机制涉及氧化应激、炎症激活和程序性细胞死亡等多方面的相互作用，最终导致细胞外基质（ECM）降解和椎间盘功能衰竭。然而，驱动IVDD的精确分子网络仍未完全明了。

随着工业进步，微塑料（MPs，<5 mm）和纳米塑料（NPs，<1000 nm）已成为普遍存在的环境污染物。人类每年估计会摄入数万颗微塑料，这引发了严重的公共健康担忧。微塑料在各种人体组织中积累，并已被证明可诱导巨噬细胞向促炎的M1表型极化，触发炎症反应，促进细胞衰老，并破坏线粒体功能。然而，聚乙烯微塑料（PE-MPs）是否以及如何参与IVDD的进程，尚属未知领域。另一方面，巨噬细胞是IVDD进展的关键调节者，在退变的椎间盘中观察到显著的巨噬细胞浸润。最近证据表明，源自M1巨噬细胞的外泌体可以诱导髓核细胞（NPCs）衰老并加速IVDD。外泌体作为细胞间通讯的关键介质，能够运输各种生物活性分子。重要的是，新兴证据表明，细胞外囊泡（EVs）可以介导环境污染物的转运。那么，一个关键的科学问题产生了：PE-MPs是否能够借助巨噬细胞来源的外泌体进入髓核细胞，从而引发一系列病理反应，最终推动椎间盘退变？这项发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》上的研究，正是为了回答这个问题。

为了揭示PE-MPs在IVDD中的作用机制，研究人员综合运用了多种关键技术方法。研究团队首先从经PE-MPs处理的巨噬细胞中分离出外泌体（M0-MPs-exo），并利用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）和蛋白质印迹（Western blot）对其进行了表征。他们建立了体外髓核细胞培养模型以及大鼠体内IVDD模型，通过细胞共培养、药物干预（如铁死亡诱导剂Erastin、抑制剂Ferrostatin-1、外泌体分泌抑制剂GW4869）、基因操作（过表达或敲低NAT10和SLC7A11）等方式处理细胞。随后，采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测细胞活力，通过蛋白质印迹、免疫荧光、免疫组织化学、实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）等技术分析关键蛋白和基因的表达水平。此外，还利用流式细胞术、点印迹（Dot blot）、特定荧光染色等方法评估了活性氧（ROS）水平、脂质过氧化、铁离子（Fe²⁺）浓度、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）含量以及ac⁴C修饰水平。最后，通过X射线分析和苏木精-伊红（H&E）染色评估了大鼠椎间盘的形态学变化。

2.1. 巨噬细胞源性PE-MPs外泌体的分离及其对NPCs中ECM代谢的影响

研究人员成功从经PE-MPs处理的M0巨噬细胞中分离出外泌体（M0-MPs-exo），并证实其具有典型的外泌体特征。有趣的是，透射电镜成像显示完整的PE-MPs被包裹在M0-MPs-exo内部，并且在巨噬细胞膜边缘也观察到了类似的含PE-MPs的囊泡，提示主动的外泌体介导的运输机制可能参与了MP的处理。通过PKH26标记和外泌体摄取实验，证实了M0-MPs-exo能够被NPCs内化，并且PE-MPs可以通过此途径被转运至NPCs。进一步的实验表明，与对照组相比，PE-MPs、脂多糖（LPS）诱导的M0巨噬细胞、M0-MPs-exo等处理均能显著上调NPCs中基质降解酶MMP13的表达，而下调ECM主要成分COL2A1的表达。使用外泌体分泌抑制剂GW4869或M1极化抑制剂米诺环素（Minocycline）能够显著逆转M0-MPs-exo或PE-MPs处理的巨噬细胞所引起的ECM代谢紊乱。这些结果证明，巨噬细胞的极化状态及其衍生的M0-MPs-exo能够驱动NPCs中的ECM代谢失调。

2.2. PE-MPs对NPCs氧化应激和铁死亡相关因子的影响

为了探究PE-MPs对NPCs氧化应激和铁死亡的影响，研究人员检测了相关蛋白的表达。结果显示，与对照组相比，PE-MPs处理能显著下调NPCs中铁死亡相关蛋白NAT10和SLC7A11的表达，同时上调衰老相关蛋白P53和P21的表达。此外，研究人员还利用白细胞介素-1β（IL-1β）建立了NPCs的衰老模型。免疫荧光、蛋白质印迹和RT-qPCR结果均证实，在PE-MPs处理组和衰老模型组中，NAT10的表达均显著降低，且两组间无显著差异。同时，PE-MPs处理还显著增加了NPCs中的活性氧（ROS）水平和ac⁴C修饰水平。这些发现表明，PE-MPs在NPCs衰老和铁死亡中扮演着关键角色。

2.3. NAT10在PE-MPs诱导的NPCs铁死亡中的作用

由于观察到NAT10的低表达，研究人员进一步探讨了NAT10在PE-MPs诱导的NPCs铁死亡中的作用。他们首先确定了PE-MPs处理NPCs的临界浓度（300 ng/mL）。随后，通过基因操作过表达或敲低NAT10，并联合使用铁死亡诱导剂（Erastin）或抑制剂（Ferrostatin-1）进行处理。结果发现，过表达NAT10能显著逆转PE-MPs引起的铁死亡相关蛋白（NAT10, SLC7A11, GPX4）下调以及衰老相关蛋白（P53, P21）上调。而敲低NAT10则加剧了PE-MPs对铁死亡相关蛋白的抑制效应。在氧化应激指标方面，NAT10过表达能显著提高SOD和GSH水平，降低MDA水平、脂质过氧化程度和Fe²⁺浓度，并且上调ac⁴C修饰水平；而敲低NAT10则产生相反的效果。这些结果提示，NAT10对PE-MPs诱导的NPCs铁死亡和细胞衰老具有保护作用。

2.4. SLC7A11和NAT10在PE-MPs诱导的NPCs铁死亡中的协同调控

为了揭示SLC7A11和NAT10在PE-MPs诱导的铁死亡反应中的关系，研究人员在NPCs中同时操作了NAT10和SLC7A11的表达。研究发现，在PE-MPs处理的NPCs中，过表达NAT10能够降低脂质过氧化水平和MDA含量，提高GSH水平；然而，如果在过表达NAT10的同时敲低SLC7A11，则NAT10的这些保护效应会被显著逆转。相反，敲低NAT10会加剧脂质过氧化和MDA积累，降低GSH，但同时过表达SLC7A11则可以部分抵消敲低NAT10带来的负面影响。蛋白质印迹和免疫细胞化学染色结果进一步证实，NAT10过表达对铁死亡和衰老相关蛋白表达的改善作用，可被SLC7A11的敲低所逆转；而NAT10敲低的负面效应也可被SLC7A11的过表达所部分挽救。这些发现表明，SLC7A11能够与NAT10协同作用，共同调控铁死亡抵抗，从而延缓细胞衰老。

2.5. NAT10介导的铁死亡在IVDD中的体内分析

最后，研究人员在大鼠体内进一步验证了NAT10介导的铁死亡在IVDD调控中的作用。通过X射线分析大鼠尾椎的椎间盘高度指数（DHI）发现，PE-MPs暴露组椎间盘高度显著降低。组织病理学分析显示，PE-MPs组大鼠表现出典型的IVDD特征，包括纤维环结构紊乱和髓核细胞变性。联合使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1能部分改善组织损伤，而NAT10过表达联合Ferrostatin-1处理则能更好地维持正常的椎间盘组织结构。分子检测证实，在PE-MPs + ov-NAT10 + Ferrostatin-1组中，铁死亡相关蛋白（NAT10, SLC7A11, GPX4）的表达水平恢复至与对照组相似，ac⁴C修饰水平也与对照组无显著差异。这些体内实验结果明确表明，NAT10过表达能有效阻断PE-MPs诱导的铁死亡激活，从而延缓IVDD的进展。

综上所述，本研究通过系统的体内外实验证实，环境污染物聚乙烯微塑料（PE-MPs）可被巨噬细胞内化，并借助其衍生的外泌体（M0-MPs-exo）转运至椎间盘髓核细胞（NPCs）。进入NPCs后，PE-MPs通过下调NAT10的表达，抑制其下游的SLC7A11/GPX4信号轴，同时增强ac⁴C RNA修饰水平，进而触发脂质过氧化和铁死亡。此外，PE-MPs还能激活P53-P21通路，诱导细胞衰老，形成铁死亡与衰老的恶性循环。研究的重要发现在于，靶向NAT10或将其与铁死亡抑制剂联合应用，能显著改善PE-MPs引起的椎间盘退行性病变。

这项研究的科学意义重大。它首次可视化了PE-MPs通过外泌体进行跨细胞运输的过程，并将环境污染物与椎间盘退变直接联系起来。研究揭示的NAT10/SLC7A11/ac⁴C轴为理解IVDD中铁死亡的调控机制提供了全新视角，超越了传统的p53调控范式。从转化医学角度看，该研究不仅验证了抑制外泌体分泌（GW4869）或巨噬细胞M1极化（米诺环素）作为潜在治疗策略的可行性，还创新性地提出了利用工程化外泌体作为“特洛伊木马”精准递送NAT10或铁死亡抑制剂至靶细胞的治疗概念。尽管研究存在一些局限性，例如人体椎间盘内PE-MPs的实际暴露水平尚不明确，以及NAT10调控网络是否涉及其他通路有待探索，但无疑为开发针对环境因素相关脊柱退行性疾病的创新防治策略奠定了坚实的理论基础，并提供了有前景的干预靶点。