水稻卤酸脱卤酶OsHAD-2介导的脱卤与水解代谢途径降低恶草酮和乙氧氟草醚的环境风险

《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》：Haloacid dehalogenase–mediated dehalogenation and hydrolysis of oxadiazon and oxyfluorfen mitigate environmental risks in rice production

本研究针对原卟啉原氧化酶类除草剂恶草酮(ODZ)和乙氧氟草醚(OFF)在稻田环境中的残留污染问题，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术构建OsHAD-2过表达和敲除水稻株系，发现OsHAD-2定位于质膜，其过表达通过增强脱卤和水解代谢活性，显著提高水稻对ODZ/OFF的耐受性，降低植株内母体化合物积累，促进降解产物生成，为培育抗除草剂水稻品种和农田污染修复提供新策略。

　　

在当今全球粮食安全面临严峻挑战的背景下，水稻作为养活世界半数以上人口的主粮作物，其安全生产至关重要。然而，现代农业中广泛使用的化学除草剂在提高作物产量的同时，也带来了不容忽视的环境污染和食品安全隐患。其中，原卟啉原氧化酶（PPO）抑制剂类除草剂恶草酮（oxadiazon, ODZ）和乙氧氟草醚（oxyfluorfen, OFF）因其高效除草效果而被广泛应用于水稻、大豆和棉花等作物田间杂草防治。但这些卤代芳香族化合物在环境中持久性强，ODZ在土壤中残留会导致作物持续吸收积累，OFF的半衰期更是长达72-150天，它们通过食物链传递可能引发哺乳动物甲状腺肿大、肝脏损伤甚至致癌风险，对生态系统和人类健康构成严重威胁。

面对这一挑战，传统物理化学降解方法成本高且易产生二次污染，而利用植物自身代谢能力实现农药残留的绿色去除则显示出独特优势。植物对外源化合物的代谢通常包括三个阶段：Phase I反应（如脱卤、水解、氧化）、Phase II结合反应（与葡萄糖、谷胱甘肽等结合）和Phase III区室化反应。卤酸脱卤酶（haloacid dehalogenase, HAD）作为Phase I反应的关键酶类，能够催化卤代有机物的脱卤反应，将其转化为毒性较低的羟基化产物，但在作物中的具体功能机制尚不明确。

为此，发表在《Environmental Chemistry and Ecotoxicology》上的这项研究，聚焦于水稻中一个新发现的HAD家族成员——OsHAD-2（LOC_Os03g49440），系统阐明了其在降解ODZ和OFF中的核心作用及分子机制。

研究人员首先通过定量PCR技术发现，ODZ和OFF胁迫能够显著诱导OsHAD-2基因表达，在0.15 mg/L浓度处理下，根部和叶片中的表达量分别上调7.75倍和6.48倍（ODZ）以及5.63倍和5.75倍（OFF）。亚细胞定位实验进一步揭示OsHAD-2蛋白定位于细胞质膜，这为其直接参与外源物质代谢提供了细胞学基础。

为明确OsHAD-2的功能，团队利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了OsHAD-2敲除突变体（Cas9），同时通过农杆菌介导的遗传转化获得了OsHAD-2过表达（OE）水稻株系。在短周期（6天）和全生育期（120天）暴露实验中，过表达株系表现出显著的生长优势：生物量增加、叶绿素含量升高、膜脂过氧化产物丙二醛（MDA）含量降低，同时超氧化物歧化酶（SOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）和谷胱甘肽S-转移酶（GST）等抗氧化和解毒酶活性显著增强。相反，敲除突变体则出现更严重的毒害症状。

关键发现在于，OE株系能够更高效地去除培养介质中的ODZ和OFF，分别比野生型（WT）高出14%和32%，且植株各组织（根、茎叶、穗粒）中母体化合物积累量显著降低。利用高效液相色谱-线性离子阱串联质谱（HPLC-LTQ-MS/MS）技术，研究人员系统鉴定了ODZ和OFF在水稻体内的代谢产物：共发现6种ODZ代谢物和9种结合物，其中3种代谢物和2种结合物为首次报道；OFF则鉴定出3种代谢物和11种结合物。特别值得注意的是，OE株系中脱卤/水解代谢产物（如脱氯-水解-恶草酮，m/z 327；水解-硝基还原-乙氧氟草醚，m/z 314）的含量显著高于WT，其中稻米中的积累量分别达到WT的2.13倍和2.70倍。

通过生态结构-活性关系模型（ECOSAR）预测，这些代谢产物的急慢性毒性均显著低于母体化合物，部分产物甚至被归类为"无害"级别。这表明OsHAD-2介导的代谢途径确实实现了污染物的解毒化过程。

综合代谢产物分析，研究团队提出了ODZ和OFF在水稻体内的完整代谢通路：OsHAD-2首先催化脱卤和水解反应（Phase I），产生羟基化中间产物；随后通过糖基化、乙酰化及与半胱氨酸等氨基酸结合（Phase II）；最终产物被转运至液泡或整合到细胞壁中（Phase III）完成彻底降解。

该研究不仅首次揭示了OsHAD-2在作物除草剂代谢中的核心地位，更重要的是为培育低农药残留的水稻新品种提供了直接靶点。过表达OsHAD-2的水稻不仅能够增强自身对除草剂的耐受性，提高在污染土壤中的生存能力，还能通过根系吸收和降解环境中的农药残留，实现"边生产边修复"的双重功效。这对于保障粮食安全、推进绿色农业具有重要的理论和实践价值。