细胞表面RNA生物学：前沿工具推动检测技术革新

《Protein & Cell》：Tools advancing the detection of cell surface RNAs

本文推荐了Jiang等人发表于《Protein & Cell》的研究，他们开发了Intact-Surface-FISH和AMOUR两种方法，分别通过成像和测序实现对细胞表面RNA的直接可视化与全面测序，揭示了包括tRNA、XIST等在内的复杂表面RNA景观，为理解细胞表面RNA的生物学功能及其与疾病（如自身免疫）的关联提供了关键工具和见解。

　　

长久以来，细胞表面一直是生物学家研究的焦点，但其主角通常是蛋白质、脂质和聚糖这些经典生物大分子。它们在细胞识别、信号传导和免疫应答中扮演着关键角色，并且一个共同特征是常常被糖基化修饰，这种修饰对于它们在细胞外空间的正确定位、折叠和功能发挥至关重要。然而，生命世界总是充满惊喜，一个意想不到的“演员”最近登上了细胞表面的舞台——核糖核酸（RNA）。传统观念认为，RNA主要存在于细胞核和细胞质中，执行基因编码和调控等功能。这一认知被一项突破性发现所颠覆：研究发现，一些小的非编码RNA竟然也能作为N-连接糖基化的模板，从而产生了一类全新的生物分子——糖基化RNA（glycoRNA）。后续研究更是鉴定出连接RNA与糖链的共价键，这为探索一个更为广阔的细胞表面RNA生物学领域奠定了框架。

既然细胞表面存在RNA，那么如何“看到”它们就成为理解其功能的第一步。可视化细胞表面RNA的能力对于揭示其作用机制至关重要。然而，大多数成像技术的前提是预先知道要观察的目标是什么，因此，对表面呈现的RNA进行测序鉴定就成为至关重要的初始步骤。早期的研究发现，被糖基化修饰的RNA主要是小的非编码RNA，包括转运RNA（tRNA）、Y RNA、小核RNA（snRNA）和小核仁RNA（snoRNA）。同时，通过生化方法分离细胞膜并结合测序技术，也提供了某些更长RNA分子也与膜结构相关的证据。在这些发现之后，科研人员投入了大量精力来开发成像糖基化RNA的方法，其中许多技术依赖于靶向糖链和靶向RNA的试剂之间的近距离相互作用来实现特异性检测。相比之下，能够更广泛地分析细胞表面RNA组成的测序技术的发展相对滞后。

正是为了弥补这一技术空白，Jiang及其同事在《Protein & Cell》上发表的最新研究中，聚焦于开发两种相互关联的新方法：分别用于成像的“完整表面荧光原位杂交”（Intact-Surface-FISH）和用于测序的“膜外表面RNA原位扩增”（in-situ Amplification of Membrane Outer-surface RNAs, AMOUR）。这项研究旨在为细胞表面RNA的探索提供更强大的“显微镜”和“普查工具”。

为了开展这项研究，研究人员主要依赖了几项关键技术。首先是Intact-Surface-FISH技术，该技术直接在活细胞状态下，使用荧光标记的DNA探针与候选表面RNA杂交，无需固定或透化细胞，通过温和洗涤保持细胞活性，确保了检测信号的特异性源于细胞外表面的RNA。其次是AMOUR技术，研究人员将固定后的完整细胞固定在伴刀豆球蛋白A包被的磁珠上，然后使用带有T7启动子和随机9碱基突出端的DNA探针与表面RNA杂交。随后，利用T7 RNA聚合酶进行原位转录，从探针“跳跃”到RNA模板上，实现RNA的扩增，最终通过高通量测序进行读取。为了验证AMOUR信号确实来自细胞表面，研究团队设置了严格的对照实验，包括用RNase预处理活细胞、与裂解细胞对照组进行比较，以及使用膜淬灭剂排除内部RNA信号的干扰。

Intact-Surface-FISH实现对细胞表面RNA的直接可视化

研究人员开发Intact-Surface-FISH的初衷是直接观察暴露在细胞质膜外侧的RNA。在该实验中，活细胞与荧光标记的、互补于候选表面RNA的DNA探针共同孵育。为了确保检测的特异性仅限于细胞表面，实验过程不进行任何固定或透膜处理；相反，使用1 mM ATP进行温和洗涤以替代传统FISH中的甲酰胺，从而维持细胞活力并防止RNA变性。研究人员最初在HeLa和HEK293T细胞上使用随机的20碱基DNA探针进行测试，结果在细胞膜区域观察到了明显的信号。重要的是，当使用RNase处理细胞后，这些信号显著减弱，证实了所检测到的信号是RNA依赖性的。这为直接观察细胞表面的RNA分布提供了有力的工具。

AMOUR测序技术揭示细胞表面RNA的复杂景观

将上述原理拓展至发现未知表面RNA，作者开发了AMOUR方法。在此方法中，固定后的完整细胞被固定在凝集素包被的磁珠上，便于对整个细胞进行实验操作。接着，加入含有T7启动子和随机9碱基突出端的DNA探针，使其与表面RNA杂交。T7 RNA聚合酶随后进行原位转录，从探针“跳跃”到表面RNA模板上，生成扩增的RNA产物，用于后续的反转录和高通量测序。通过这种方法，研究人员能够无偏倚地捕获细胞表面的RNA组成。结合AMOUR测序数据和Intact-Surface-FISH的验证，研究团队鉴定出多种存在于细胞表面的RNA类型，包括tRNA（特别是线粒体tRNA）、snoRNA、snRNA、Y RNA以及其他多种非编码RNA。这些类别与之前发现的糖基化RNA类型高度重合。此外，AMOUR数据中还发现了一些更长的非编码RNA，例如在X染色体沉默中起关键作用且与自身免疫疾病相关的XIST，以及线粒体核糖体RNA（如MTRNR2）。这些发现揭示了细胞表面RNA世界的复杂性和多样性。

综上所述，Jiang等人的研究通过开发Intact-Surface-FISH和AMOUR这一对互补的技术平台，极大地推动了细胞表面RNA生物学的研究。这些数据描绘了一幅复杂的细胞表面RNA图谱，但仍有诸多问题有待解答。像AMOUR这样能够对稀有细胞群体进行采样的测序方法，将有助于绘制新的细胞表面RNA图谱。而利用Intact-Surface-FISH等技术对这些测序图谱产生的数据进行验证和功能背景阐释将至关重要。未来，开发能够获得更高分辨率视图以及多靶点信息的技术方法，将进一步加深我们对RNA在细胞表面组织方式的理解。此外，理解在细胞表面检测到的任何RNA与其化学修饰景观（特别是糖基化修饰的类型和位点）之间的关系，也将是一个极具吸引力的研究方向。这项研究不仅提供了强大的工具，更重要的是打开了通往细胞表面RNA这一新兴生物学领域的大门，为未来探索其在细胞间通讯、免疫识别以及疾病发生发展中的作用奠定了坚实的基础。