单细胞与机器学习分析揭示牙周炎新型炎症巨噬细胞亚型及诊断标志物

《International Dental Journal》：Single-Cell and Machine Learning Analysis Reveal Novel Inflammatory Macrophage Subtypes and Biomarkers in Periodontitis

本研究针对牙周炎(PD)中巨噬细胞异质性不清的问题，通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)结合机器学习，识别出新型PD相关巨噬细胞亚群(PD-MΦ)，揭示了其促炎及免疫代谢特征，并构建了基于CXCR4、ATF3、TXN、CBX3和MBP五个关键基因的诊断模型(PMRGS，AUC=0.88)，为PD的早期诊断和靶向治疗提供了新见解。

　　

牙周炎是一种常见的慢性炎症性疾病，影响着全球约20%至50%的人口，是导致成年人牙齿丧失的主要原因。它不仅造成牙龈炎症、牙周袋形成、牙槽骨吸收等局部组织破坏，更被视为一种由宿主-微生物相互作用驱动的复杂病理过程。传统观点认为细菌感染是罪魁祸首，但越来越多的证据表明，宿主免疫反应的失调在牙周组织的进行性破坏中扮演了更为关键的角色。在这一复杂的免疫细胞网络中，巨噬细胞作为前沿的免疫哨兵，具有双重作用：一方面，它们通过强大的吞噬功能清除病原体和细胞碎片；另一方面，其过度激活会释放大量促炎介质，导致牙周组织“误伤”，加剧疾病进展。因此，深入理解巨噬细胞在牙周炎中的作用机制，对于开发新的治疗策略至关重要。

长期以来，巨噬细胞被简单地划分为促炎的M1型和抗炎/修复的M2型。然而，这种二元分类法过于简化，无法充分反映在复杂组织微环境和疾病状态下巨噬细胞真实的异质性。在牙周炎这样的慢性炎症中，维持适当的M1/M2平衡对于免疫稳态至关重要，但牙周组织中巨噬细胞的表型谱系、分子特征及其临床相关性仍未完全阐明。克服这一瓶颈需要能够在单细胞水平上解析细胞异质性的高分辨率技术。

近期发表在《International Dental Journal》上的一项研究，题为“Single-Cell and Machine Learning Analysis Reveal Novel Inflammatory Macrophage Subtypes and Biomarkers in Periodontitis”，由广西医科大学口腔医学院预防口腔医学系的陈绍勇等人完成。该研究巧妙地结合了单细胞RNA测序(scRNA-seq)和机器学习算法，旨在深入揭示牙周炎中巨噬细胞的异质性，鉴定与疾病相关的关键巨噬细胞亚群，并探索其诊断和预后价值。

为了系统回答上述科学问题，研究人员部署了一套整合多种生物信息学与实验验证的技术路线。其核心数据来源是牙周炎患者和健康对照者牙龈组织的公共scRNA-seq数据集(GSE171213)，该数据集经过严格的质控、批次效应校正和无监督聚类分析，用于描绘细胞图谱和识别巨噬细胞亚群。此外，研究还利用了来自基因表达综合数据库(GEO)的多个批量转录组数据集(GSE10334, GSE16134, GSE106090, GSE173078)用于后续的模型构建与验证。关键技术方法包括：利用Monocle软件进行伪时间轨迹分析以推断细胞分化动态；运用CellChat工具推断细胞间通讯网络；通过高维加权基因共表达网络分析(hdWGCNA)识别关键基因模块；并整合十种机器学习算法（如LASSO、弹性网络、随机生存森林等）来筛选稳健的诊断生物标志物和构建预测模型。最后，通过体外实验，使用PMA诱导的THP-1来源巨噬细胞，并在脂多糖(LPS)刺激下模拟牙周炎炎症环境，对关键发现进行了qRT-PCR和蛋白质印迹(Western blot)验证。

单细胞转录组图谱揭示牙周炎细胞组成改变

通过对牙周组织scRNA-seq数据的分析，研究共保留了33,405个高质量细胞，并将其注释为12个主要的细胞类型，包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、内皮细胞等。比较分析发现，与健康组织相比，牙周炎组织中内皮细胞、NK细胞、巨噬细胞、浆细胞等比例显著增加，而T细胞、B细胞和组织干细胞的比例则下降。这提示牙周炎病变部位存在显著的免疫细胞浸润和稳态失衡。

牙周炎中巨噬细胞亚群的异质性特征

研究人员进一步对巨噬细胞群体进行了深入分析，识别出11个不同的巨噬细胞亚群。其中，亚群5、8和10在牙周炎样本中显著富集，因此被定义为牙周炎相关巨噬细胞(PD-MΦ)。基因集富集分析(GSEA)显示，PD-MΦ高表达基因显著富集于氧化磷酸化、Rap1信号通路、糖酵解/糖异生等通路，表明其发生了显著的代谢重编程。代谢通路分析进一步揭示PD-MΦ在脂肪酸延伸、赖氨酸降解、抗坏血酸代谢和叶酸介导的一碳代谢等通路上活性增强。

伪时间轨迹和CellChat分析

伪时间轨迹分析显示，PD-MΦ位于巨噬细胞分化轨迹的末端，暗示其可能代表一种特定的分化状态。细胞通讯分析表明，PD-MΦ与多种免疫细胞和基质细胞存在广泛的相互作用，特别是通过GRN-SORT1、MIF-(CD74+CD44)等配体-受体对进行信号传导，GypA、GALECTIN和ANNEXIN信号通路在PD-MΦ相关的互作中显著上调，凸显了其在协调牙周微环境细胞反应中的核心作用。

hdWGCNA识别PD-MΦ相关枢纽基因模块

通过hdWGCNA分析，研究人员构建了基因共表达网络，并识别出15个模块。其中5个模块（棕色、青绿色、鲑鱼色、绿色和黑色）与PD-MΦ高度相关。对这些模块基因进行深入分析，为后续标志物筛选奠定了基础。

机器学习筛选PD-MΦ特征基因并构建诊断模型

基于hdWGCNA发现的枢纽基因，研究人员应用LASSO回归等机器学习算法，从外部批量数据集(GSE10334)中筛选出22个候选基因。通过蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络分析，进一步聚焦到5个核心基因：CXCR4、ATF3、TXN、CBX3和MBP。在牙周炎样本中，CXCR4和ATF3表达上调，而TXN、CBX3和MBP表达下调。以此五个基因构建的PD-MΦ相关基因标签(PMRGS)在训练集和多个独立验证集中均表现出良好的诊断性能，曲线下面积(AUC)达到0.88。

免疫细胞浸润分析

免疫浸润评估显示，牙周炎组织中髓源性抑制细胞(MDSCs)、活化的CD8⁺和CD4⁺ T细胞等比例增加，而单核细胞、未成熟树突状细胞、某些NK细胞和T细胞亚群比例减少。核心基因与免疫细胞的相关性分析显示，CXCR4与大多数免疫细胞呈正相关，而TXN、CBX3和MBP则主要呈负相关，提示这些基因在牙周炎免疫调节中可能扮演不同角色。

关键基因的实验验证

最后，通过体外实验验证了这五个关键基因的表达。在LPS刺激的THP-1来源巨噬细胞（模拟牙周炎环境）中，qRT-PCR和Western blot结果均证实了CXCR4和ATF3的表达上调，以及TXN、CBX3和MBP的表达下调，这与生物信息学分析结果一致，为这些基因在PD-MΦ中的重要作用提供了实验支持。

该研究的讨论部分对上述发现进行了深入阐释。研究成功鉴定了一个先前未被描述的、与牙周炎相关的巨噬细胞亚群(PD-MΦ)，该亚群具有独特的代谢适应和免疫调节功能，可能促进了牙周炎的慢性炎症反应。PD-MΦ的转录谱表明其在维持局部炎症环境、调节免疫动态和促进组织降解中起关键作用。其代谢重编程（如增强的氧化磷酸化和糖酵解）可能为满足慢性炎症的高能量需求提供了基础。转录因子RFX5、CIITA和RFXANK的活性升高，提示PD-MΦ的抗原呈递能力可能增强。细胞通讯分析揭示了PD-MΦ通过特定的配体-受体对（如GRN-SORT1, MIF-CD74/CD44）在牙周微环境中处于信号传导的中心节点。

综上所述，这项研究通过高精度的单细胞转录组学和计算生物学方法，揭示了牙周炎中巨噬细胞的新型功能亚群及其分子特征，并开发出具有潜在临床应用价值的诊断基因标签。这些发现不仅深化了对牙周炎免疫病理机制的理解，也为开发基于巨噬细胞靶向的精准诊断和干预策略提供了新的理论依据和候选靶点。未来的研究可在更大规模的队列中验证这些标志物，并利用空间转录组学等技术进一步阐明PD-MΦ在牙周组织破坏与修复过程中的空间定位和功能。