基于基因编码的FRET技术的纳米传感器，用于检测昆虫幼虫激素

《ACS Omega》：Genetically Encoded FRET-Based Nanosensor for Insect Juvenile Hormone

基于甲虫JHBP的FRET荧光生物传感器FREJIA开发及其在活细胞中检测JH的应用

　　昆虫发育和生殖成熟过程中，一种名为幼激素（Juvenile Hormone, JH）的激素起着核心作用。然而，由于JH难以在不破坏细胞的情况下进行实时检测，其分子运输机制仍存在许多未知。为了填补这一空白，科学家们开发了一种基于荧光共振能量转移（F?rster Resonance Energy Transfer, FRET）原理的新型遗传编码荧光生物传感器，该传感器能够对JH及其类似物进行非破坏性、比率型的实时监测。

JH是一种由昆虫体内咽侧体（corpora allata）分泌的类萜激素，它与蜕皮激素（ecdysteroids）协同作用，调控昆虫的生长发育和生殖过程。在昆虫体内，JH通过直接核受体信号通路和间接的次级信号机制（如涉及第二信使的信号传递）来影响基因表达。JH的运输主要依赖于一种称为血淋巴JH结合蛋白（JH-binding proteins, JHBPs）的高亲和力结合蛋白，这些蛋白在昆虫血淋巴中起到稳定JH并将其传递至靶细胞的作用。尽管JH在昆虫生理过程中具有重要作用，但其运输机制和细胞内活动仍缺乏系统性的研究。传统的检测方法如液相色谱-质谱联用（LC-MS）、反相高效液相色谱（RP-HPLC）结合荧光检测以及气相色谱-质谱（GC-MS）等，虽然具有高灵敏度，但都需要细胞裂解和复杂的样品处理步骤，无法满足实时监测的需求。

为了解决这一问题，研究人员利用FRET技术构建了一种新型的JH生物传感器，称为FRET JH Indicator Agent（FREJIA）。该传感器基于来自家蚕（*Bombyx mori*）的JH结合蛋白（JHBP）作为感知域，并将两种荧光蛋白——mTFP1（供体）和mVenus（受体）——分别连接在JHBP的N端和C端。通过这种方式，当JH结合到JHBP上时，会引发JHBP构象的变化，从而改变供体和受体之间的能量转移效率，产生可检测的比率型荧光信号。

最初的传感器设计并未表现出明显的FRET变化，这可能是因为JH结合导致的N端和C端构象变化方向相反，增加了供体和受体之间的距离，从而降低了能量转移效率。为了改善这一问题，研究人员通过调整mTFP1在JHBP中的插入位置，使其位于JH结合后构象变化最为显著的区域。这种优化设计使FRET信号能够显著响应JH的结合，表明JH结合与荧光蛋白位置的变化之间建立了有效的耦合关系。最终优化后的传感器被命名为FREJIA，这是首个能够对JH进行比率型、遗传编码、荧光检测的生物传感器。

FREJIA不仅能够检测JH III，还对JH I、JH II以及结构类似物如甲基丙烯酸酯（methoprene）表现出响应。实验结果显示，该传感器在纳摩尔浓度范围内即可检测到JH的结合，并且能够用于活体哺乳动物细胞中的实时成像。这一突破为研究昆虫内分泌信号提供了新的工具，同时也为JH类似物的筛选和鉴定开辟了新的途径。

为了验证FREJIA的性能，研究人员在多种实验条件下对其进行了测试。例如，他们评估了FREJIA在不同浓度的JH类似物和代谢产物下的响应情况，发现该传感器对JH具有高度特异性，而对其他非JH类分子如油酸（oleic acid）则无明显反应。此外，实验还表明，FREJIA在温和的溶剂（如1%二甲基亚砜DMSO）或表面活性剂（如0.005% Tween 20）条件下仍能保持其结构稳定性和比率型响应能力，进一步证明了其在实验条件下的可靠性。

在活细胞成像实验中，研究人员将FREJIA基因转入人类胚胎肾细胞（HEK293T），并使用荧光显微镜进行观察。结果显示，当JH III被添加到细胞培养环境中后，FREJIA能够在几分钟内检测到其结合并产生显著的FRET信号变化。这种快速响应特性使得FREJIA成为研究JH动态变化的理想工具。相比之下，传统的JH检测方法需要较长时间的样品处理和细胞裂解，无法实现对活细胞内JH浓度的实时监测。

FREJIA的开发不仅拓展了FRET生物传感器的应用范围，还为昆虫内分泌系统的研究提供了新的视角。以往的研究多集中在植物和哺乳动物中的小分子信号检测，而FREJIA则是首个专门用于昆虫激素检测的生物传感器。这为理解昆虫激素如何在细胞内传递信号、调控基因表达以及影响发育和繁殖过程提供了重要的实验手段。此外，该传感器还可用于筛选新的昆虫生长调节剂（insect growth regulators），特别是在高通量筛选平台中，能够快速评估不同化合物对JH结合能力的影响。

在昆虫体内，JH的浓度通常处于纳摩尔级别，而FREJIA的检测灵敏度足以捕捉这一范围内的变化，表明其在活体检测中的可行性。例如，在*Manduca sexta*（烟草天蛾）中，JH在血淋巴中的浓度约为150 nM，而FREJIA在10 nM的浓度下即可产生可测量的FRET信号变化，这说明该传感器具有良好的检测性能。通过FREJIA，科学家们可以更深入地研究JH在不同生理条件下的动态变化，从而揭示其在昆虫发育、繁殖和生理调控中的具体作用机制。

此外，FREJIA的结构设计也为其他类似生物传感器的开发提供了借鉴。该传感器利用JHBP的构象变化作为信号传递的基础，将这种变化转化为供体和受体之间的能量转移。这种设计思路不仅适用于JH的检测，还可以推广到其他激素或信号分子的监测。例如，近年来已有研究利用类似的FRET技术开发了针对葡萄糖、钙离子等小分子的生物传感器，而FREJIA的出现进一步丰富了这一领域，为昆虫内分泌系统的可视化研究提供了新的可能性。

FREJIA的成功开发标志着在昆虫分子生物学领域的一项重要进展。它不仅能够实现对JH的实时、非破坏性检测，还具备高灵敏度和特异性，适用于多种实验场景。未来，这一技术有望被应用于更广泛的昆虫研究中，例如探讨JH在不同昆虫物种中的功能差异、研究其在环境应激或疾病状态下的变化，以及开发基于JH的新型生物调控手段。同时，FREJIA的结构优化也为其他生物传感器的开发提供了技术基础，推动了分子成像技术在昆虫生物学中的应用。

总的来说，FREJIA的开发填补了昆虫激素实时检测的技术空白，为理解昆虫内分泌系统的动态过程提供了强有力的工具。其基于FRET的比率型信号输出、遗传编码的特性以及对多种JH类似物的响应能力，使其在昆虫生理研究、药物筛选以及环境监测等方面具有广阔的应用前景。随着相关技术的不断进步，FREJIA有望成为昆虫分子生物学研究中的重要组成部分，助力科学家更深入地揭示昆虫激素的复杂作用机制。