通过CRISPR-Cas13a启动的PER驱动DNA Walker实现超灵敏、无标记的医院感染RNA生物标志物检测

《ACS Omega》：Ultra-Sensitive, Label-Free Detection of Nosocomial Infection RNA Biomarkers via CRISPR-Cas13a-Initiated PER-Driven DNA Walker

医院感染早期诊断中，基于CRISPR-Cas13a/crRNA复合体的核酸扩增检测平台被开发，通过URACIL探针切割激活链式延伸反应，实现miRNA-21（0.41 fM）和circRNA（3.12 fM）的高灵敏度检测，特异性达99.43%，并验证了临床样本的适用性。

　　医院获得性感染（Hospital-Acquired Infections, HAIs）是全球范围内导致死亡的重要原因之一，给公共卫生带来了严峻的挑战。这类感染通常指患者在进入医疗环境后，因病原体侵袭而新发的感染，与入院时的健康状态无关。HAIs不仅对患者的生命安全构成威胁，还可能因抗微生物耐药性的存在而使病情更加复杂，增加患者的发病率、死亡率以及医疗资源的消耗。因此，早期发现HAIs对于及时干预和改善患者预后至关重要。近年来，研究者们发现RNA生物标志物，包括微小RNA（microRNA, miRNA）和环状RNA（circular RNA, circRNA），在HAIs的诊断中具有巨大潜力，这些标志物能够提供关键的临床信息，帮助医生在症状显现之前采取有效的措施。

为了应对现有检测技术在HAIs诊断中的局限性，科学家们致力于开发更高效、更精准的RNA生物标志物检测平台。传统的检测方法如微阵列、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和测序技术虽然在某些方面表现良好，但它们也存在明显的不足。例如，微阵列依赖于探针的可用性，容易出现交叉杂交导致的假阳性结果，且对低丰度RNA的检测不够敏感；RT-PCR虽然能够特异性识别miRNA和circRNA，但由于逆转录酶的链置换活性和引物的非特异性结合，其检测结果可能受到干扰；而测序技术则因成本高昂和操作复杂，难以在临床中广泛应用。此外，当前的检测方法常依赖于双标记核酸探针，这类探针不仅价格昂贵，而且对实验条件如pH值高度敏感，容易影响实验的稳定性和结果的准确性。

针对上述问题，研究人员提出了一种基于CRISPR-Cas系统的新型检测策略。CRISPR-Cas系统最初被认为是细菌和古菌的免疫防御机制，但近年来被广泛应用于基因编辑和生物检测领域。其中，Cas13a作为RNA靶向的核酸酶，能够通过特定的CRISPR RNA（crRNA）引导，精准识别RNA目标。这一特性使得Cas13a在HAIs的RNA生物标志物检测中展现出独特的价值。在此基础上，研究团队开发了一种结合Cas13a/crRNA复合物与引物交换反应（Primer Exchange Reaction, PER）驱动的DNA行走机制，构建了一个高效、灵敏且无需标记的RNA检测平台。

该平台的核心在于利用Cas13a的转切割活性，通过特异性识别RNA目标，触发后续的信号放大过程。具体而言，Cas13a/crRNA复合物能够特异性地结合目标RNA，并通过切割含有尿嘧啶（UUU, trU）的锁定“传感探针”（sensing probe, “sp”），释放出引物结合位点。这一过程启动了PER反应，使得引物序列在磁珠表面进行“行走”，从而实现信号的连续放大。引物探针与“sp”结合后，DNA聚合酶能够沿着模板序列进行延伸，但由于缺乏dGTP，延伸过程会在特定的终止位点停止。随后，延伸后的链与PER模板中的“2”区域竞争，释放出新的“2”序列，并与下一个PER模板结合，形成循环的信号放大机制。这一机制不仅显著提高了检测的灵敏度，还有效避免了传统方法中可能出现的假信号或非目标RNA的误切现象。

为了验证该平台的有效性，研究人员首先进行了系统可行性评估。通过荧光实验，他们确认了Cas13a/crRNA复合物在识别目标RNA时的特异性。实验结果显示，当没有目标RNA存在时，探针的荧光信号非常微弱，表明Cas13a的活性并未被激活；而当目标RNA存在时，探针被切割，释放出的引物结合位点引发PER反应，导致荧光信号的显著增强。此外，通过将“sp”和引物探针固定在链霉亲和素包被的磁珠（streptavidin-coated magnetic beads, sMBs）表面，研究人员进一步验证了探针的固定效果。荧光实验表明，探针固定后，其信号强度显著增加，而未固定的磁珠则几乎不产生信号，证明了固定过程的可靠性。

在实验参数优化方面，研究人员对多个关键因素进行了系统评估，包括“sp”与引物探针的浓度比、酶反应时间、Bst DNA聚合酶的用量以及Thioflavin T（ThT）的浓度。通过调整这些参数，他们成功提高了检测的灵敏度和特异性。例如，Bst DNA聚合酶的浓度对信号强度有显著影响，最佳浓度被确定为10 U/mL；Cas13a的浓度则被优化为6 U/mL，以确保其在不引发非特异性切割的情况下高效识别目标RNA；“sp”与引物探针的浓度比在10:1时达到最佳信号响应；酶反应时间在90分钟内达到峰值，进一步延长则对信号提升无明显影响；ThT的浓度在2 mM时达到最大信号强度，表明该浓度能够有效结合DNA链，产生稳定的荧光信号。

为了评估该平台对miRNA-21的检测性能，研究人员对不同浓度的目标miRNA进行了测试。实验结果显示，随着miRNA浓度的增加，荧光信号也相应增强，表明该方法具有良好的线性响应范围。通过构建校准曲线，研究人员进一步验证了该方法的灵敏度和准确性。在优化条件下，该平台能够检测到低至0.41 fM的miRNA-21，这一检测限远低于传统方法，表明其在低浓度RNA检测方面具有显著优势。此外，通过与非目标序列的对比实验，研究人员证明了该方法在识别miRNA-21时具有高度的特异性，即使在存在其他miRNA或单碱基错配序列的情况下，该平台也能保持良好的信号区分能力。

在circRNA检测方面，该平台同样表现出卓越的性能。以circRNA cZNF292为检测对象，研究人员在优化条件下测试了不同浓度的cZNF292m，并发现其荧光信号随浓度增加而增强。校准曲线的构建表明，该方法在检测cZNF292m时具有良好的线性关系，检测限为3.12 fM。通过与非目标序列的对比实验，研究人员进一步确认了该方法在识别cZNF292m时的高特异性，即使在存在三个碱基错配序列或与cZNF292m具有相似序列的miR-21时，其荧光信号也显著低于目标序列，表明该方法能够有效避免非特异性识别带来的干扰。

为了验证该平台在实际临床样本中的应用潜力，研究人员进行了加标回收实验，测试了其在健康人血清中的检测性能。实验结果显示，该方法在检测miRNA-21时的回收率在98.10%至103.2%之间，相对标准偏差（RSD）在3.54%至4.47%之间，表明其在复杂基质中的检测结果具有良好的准确性和重复性。此外，该方法在不同天数内的检测结果保持一致，证明了其良好的日内和日间稳定性。通过与传统的RT-PCR方法进行对比，研究人员发现该平台在检测miRNA-21时的荧光信号与RT-PCR的结果具有高度一致性，相关系数（R2）达到0.9943，进一步验证了其在临床诊断中的可靠性。

综上所述，这项研究提出了一种基于CRISPR-Cas系统的新型RNA生物标志物检测平台，该平台结合了Cas13a/crRNA复合物的高特异性识别能力和PER驱动的DNA行走机制，实现了对miRNA和circRNA的高灵敏度、高选择性检测。该方法无需使用复杂的标记探针，降低了实验成本，同时避免了传统方法中常见的假信号问题。通过实验验证，该平台在检测miRNA-21和cZNF292m时均表现出优异的性能，尤其在低浓度检测方面具有显著优势。此外，该方法在实际临床样本中的应用也显示出良好的准确性和稳定性，为未来HAIs的早期诊断和个性化治疗提供了新的技术路径。

随着对RNA生物标志物研究的不断深入，该平台的开发为HAIs的诊断带来了重要的技术突破。由于RNA标志物在疾病早期即可出现，且具有较高的稳定性，因此其在临床中的应用前景广阔。该平台不仅能够用于HAIs的检测，还可能扩展至其他疾病的早期预警和诊断。例如，miRNA和circRNA在多种疾病中均表现出独特的表达模式，如癌症、心血管疾病和神经退行性疾病等。因此，这种基于CRISPR-Cas系统的检测方法有望在更广泛的医学领域中发挥作用。

此外，该平台的模块化设计使其具备良好的可扩展性。通过调整crRNA的序列，研究人员可以轻松适配不同的RNA目标，从而实现对多种RNA标志物的检测。这种灵活性使得该方法能够适应不同类型的疾病诊断需求，同时减少了实验操作的复杂性。由于无需复杂的标记步骤，该方法的操作流程更加简便，适合在资源有限的环境中推广应用。这一特性对于发展中国家或基层医疗机构尤其重要，因为这些机构往往缺乏先进的检测设备和复杂的实验条件。

该平台的另一个显著优势在于其无需预处理的特性。传统RNA检测方法通常需要对样本进行复杂的提取和纯化步骤，以去除干扰物质并提高检测的准确性。而该方法通过将“sp”和引物探针固定在磁珠表面，直接利用Cas13a/crRNA复合物识别目标RNA，从而简化了实验流程，提高了检测效率。这一特性不仅降低了实验的时间成本，还减少了人为操作带来的误差，提高了检测结果的可靠性。

该研究的成果表明，基于CRISPR-Cas系统的RNA检测方法在HAIs的诊断中具有巨大的应用潜力。由于其高灵敏度和高特异性，该平台能够在疾病早期阶段提供可靠的检测结果，为临床干预争取宝贵时间。此外，该方法的低成本和高通量特性也使其在大规模筛查和实时监测中具有优势。未来，随着自动化操作系统的进一步开发，该平台有望实现更高效、更便捷的RNA标志物检测，从而在HAIs的早期预警和精准诊断中发挥更大作用。

总的来说，这项研究不仅为HAIs的RNA标志物检测提供了一种新的技术方案，还为未来疾病诊断和治疗提供了重要的理论支持和实践指导。通过结合CRISPR-Cas系统的高特异性识别能力和PER驱动的DNA行走机制，研究人员成功构建了一个高效、灵敏且用户友好的检测平台。该平台的开发不仅有助于提高HAIs的诊断效率，还为其他RNA相关疾病的早期检测和治疗提供了新的思路和技术手段。随着研究的不断深入和技术的持续优化，这种基于CRISPR-Cas系统的检测方法有望在临床和科研领域中得到更广泛的应用。