通过调控结合水介导的细胞-基底相互作用来构建三维细胞结构，用于疾病建模

《ACS Omega》：Engineering Three-Dimensional Cellular Organization by Regulating Bound Water-Mediated Cell–Substrate Interactions for Disease Modeling

三维细胞组织构建与代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）体外模型开发

　　这项研究探讨了利用聚(2-甲氧基乙基丙烯酸酯)（PMEA）衍生物构建新型聚合物涂层材料，以调控细胞与基质的相互作用，从而实现对细胞自组织行为的精确控制。研究者们通过调整PMEA侧链中乙二醇（EG）单元的数量，合成了一系列具有不同水合状态的嵌段共聚物，旨在开发一种既能维持细胞与基质的适当粘附，又能促进三维（3D）细胞聚集的新型材料。这项研究不仅在细胞培养领域具有重要意义，还为构建更贴近生理环境的疾病模型提供了新的思路，特别是在代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的研究中，为药物筛选和机制探索提供了可靠的平台。

### 1. 引言

细胞组织的三维结构是模拟体内环境、研究组织和器官生理行为的重要手段。传统二维（2D）细胞培养技术难以再现复杂的细胞-细胞和细胞-细胞外基质（ECM）相互作用，而细胞组织模型（organoids）则能更真实地再现这些结构和功能特征。然而，当前细胞组织技术在构建复杂组织结构和实现可重复性方面仍面临诸多挑战。PMEA及其衍生物由于其良好的生物相容性，被认为是替代传统动物源性材料如Matrigel的有潜力的合成材料。研究发现，通过改变PMEA的化学结构可以调控其水合状态，从而影响细胞的粘附行为。然而，尽管PMEA衍生物的水合状态对细胞粘附有影响，但在前人研究中，即使水合度较高，细胞仍保持二维粘附状态，未观察到三维聚集现象。这表明需要进一步优化材料的水合状态，以实现三维细胞组织的构建。此外，一些高度亲水材料如聚乙二醇（PEG）和聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱)（PMPC）虽然具有极高的水合度，但往往表现出极低的细胞粘附能力。这表明仅仅提高水合度可能无法维持细胞粘附，反而可能导致无支架的三维细胞培养。因此，研究者们提出，通过设计具有中间水合状态的材料，可以实现细胞粘附与三维组织形成的平衡。

### 2. 实验部分

#### 2.1 聚合物合成

研究团队合成了一系列PMEA衍生物及其嵌段共聚物，包括PME2A、PME3A以及它们与聚苯乙烯（PS）形成的共聚物1A、2A和3A。这些材料的化学结构和分子量通过核磁共振（NMR）和凝胶渗透色谱（GPC）进行表征。

#### 2.2 试剂和抗体

实验中使用了多种试剂和抗体，包括白蛋白、纤维连接蛋白、维生素蛋白、棕榈酸、油酸以及药物Resmetirom。此外，还使用了针对纤维连接蛋白的单克隆和多克隆抗体，用于评估细胞结合域的暴露程度。

#### 2.3 差示扫描量热法（DSC）

通过DSC分析，研究团队评估了不同聚合物的水合状态。结果显示，随着EG链长的增加，PMEA衍生物及其共聚物的结合水含量显著增加，表明水合状态与细胞粘附行为密切相关。

#### 2.4 聚合物涂层基质的制备

1A、2A和3A被溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，然后通过铸造方式涂覆在24孔板上，并在真空干燥箱中干燥18小时。这些聚合物涂层被用于后续的细胞培养实验。

#### 2.5 原子力显微镜（AFM）

使用AFM测量了1A、2A和3A涂层表面的粗糙度和弹性模量。结果显示，随着水合度的增加，表面的弹性模量降低，表明水合状态对材料的机械性能有显著影响。

#### 2.6 接触角测量

通过接触角测量评估了聚合物涂层表面的亲水性。结果显示，1A、2A和3A的接触角均低于对照组的聚苯乙烯（TCPS）基质，表明PMEA衍生物的涂层显著提高了表面的亲水性。

#### 2.7 X射线光电子能谱（XPS）

XPS分析确认了聚合物涂层在TCPS基质上的均匀性和稳定性。结果显示，1A、2A和3A的表面化学结构与对应的PMEA衍生物基本一致，表明涂层材料的成功制备。

#### 2.8 微量比色法（micro-BCA）和酶联免疫吸附测定（ELISA）

通过micro-BCA和ELISA方法评估了不同基质上蛋白的吸附量和变性程度。结果显示，随着水合度的增加，蛋白的吸附量和变性程度均降低，这可能与结合水的物理屏障有关。

#### 2.9 细胞培养

D1细胞（小鼠骨髓来源的间充质基质细胞）和HepG2细胞（人肝癌细胞）在不同的聚合物基质上进行培养。实验结果显示，随着基质水合度的增加，细胞的粘附模式从二维逐渐向三维转变。

#### 2.10 时间序列记录

使用荧光显微镜记录了D1细胞在不同基质上的动态行为。结果显示，细胞在3A基质上的迁移速度显著高于在1A基质上，表明水合度的增加促进了细胞的运动能力。

#### 2.11 单细胞力谱学（SCFS）

通过SCFS测量了细胞与基质之间的粘附力和细胞间相互作用力。结果显示，随着基质水合度的增加，细胞与基质之间的粘附力降低，而细胞间相互作用力增强，从而促进了三维细胞组织的形成。

#### 2.12 逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）

通过RT-qPCR评估了不同基质上细胞的基因表达水平，特别是炎症因子如IL-6和IL-1β的表达情况。结果显示，3A基质上的细胞表现出更高的炎症因子表达，这与三维细胞组织的形成密切相关。

#### 2.13 统计分析

所有实验数据均以平均值±标准差的形式呈现，并通过GraphPad Prism软件进行统计分析。显著性测试通过图注中说明的方法进行，以确保结果的可靠性。

### 3. 结果

#### 3.1 聚苯乙烯与PMEA衍生物的嵌段共聚物

通过调整PMEA衍生物的EG链长，研究团队成功合成了1A、2A和3A。这些材料的水合状态可以通过DSC进行定量分析，结果显示，随着EG链长的增加，结合水含量显著提高。这表明通过调控EG链长可以实现对水合状态的精确控制。

#### 3.2 聚合物基质的表面特性

XPS分析显示，1A、2A和3A的表面化学结构与PMEA衍生物基本一致，表明这些材料在TCPS基质上的均匀涂层。接触角测量进一步验证了这些材料的亲水性，AFM测量则揭示了它们的表面纳米结构和机械性能。

#### 3.3 D1细胞在不同基质上的粘附形态

在1A、2A和3A基质上培养的D1细胞表现出不同的粘附形态。1A基质上的细胞主要以二维方式粘附，而3A基质上的细胞则主要形成三维球体。SCFS分析显示，随着基质水合度的增加，细胞与基质之间的粘附力降低，而细胞间相互作用力增强，这有助于三维细胞组织的形成。

#### 3.4 蛋白吸附和变性

蛋白吸附和变性是细胞粘附的重要因素。结果显示，随着基质水合度的增加，蛋白的吸附量和变性程度均降低，这可能与结合水的物理屏障有关。这种屏障可以抑制非特异性蛋白吸附，从而减少细胞与基质之间的强相互作用。

#### 3.5 MASH模型的构建

为了验证这些材料在疾病建模中的应用，研究团队构建了一个包含HepG2细胞、LX-2细胞和THP-1衍生巨噬细胞的MASH模型。结果显示，3A基质上的细胞形成了三维组织结构，并表现出显著的脂质积累和炎症因子表达增加。Resmetirom的加入显著减少了脂质积累和炎症因子的表达，表明该模型能够有效模拟MASH的病理特征，并可用于药物筛选。

### 4. 讨论

#### 4.1 水合状态对细胞行为的影响

研究团队发现，通过调控聚合物涂层的水合状态，可以有效改变细胞的粘附行为。结合水的含量是影响细胞与基质相互作用的重要因素，而水合度的增加则会抑制这种相互作用，从而促进细胞间的聚集。这种机制在细胞组织的形成中具有重要意义。

#### 4.2 材料表面的微观结构

AFM测量显示，1A、2A和3A基质上的表面微观结构存在差异。这些结构可能影响细胞粘附受体的分布，从而改变细胞间的相互作用。这种微观结构的调控为实现细胞行为的精确控制提供了新的思路。

#### 4.3 水合度与细胞功能的关联

研究团队发现，水合度的增加不仅影响细胞的粘附行为，还可能影响细胞的功能表达。例如，在3D培养条件下，HepG2细胞表现出更高的白蛋白分泌能力，这可能与E-钙粘蛋白的表达有关。此外，炎症因子如IL-6和IL-1β的表达水平也受到水合度的影响，这表明水合度在疾病建模中具有重要作用。

#### 4.4 材料的生物相容性

PMEA衍生物具有良好的生物相容性，其水合状态的调控为构建更贴近生理环境的细胞组织提供了可能。研究团队认为，这些材料可以作为合成支架材料，用于细胞组织工程和疾病建模。

#### 4.5 三维培养的优势

与传统的二维培养相比，三维培养能够更真实地模拟体内环境，促进细胞间的相互作用，并维持细胞的生理功能。研究团队构建的MASH模型不仅能够再现脂质积累和炎症反应，还表现出对药物Resmetirom的良好响应，这表明该模型在药物筛选中具有潜在的应用价值。

### 5. 结论

这项研究通过调控PMEA衍生物的水合状态，成功构建了一种新型的聚合物涂层材料，能够促进细胞从二维粘附向三维组织的转变。此外，研究团队还利用这些材料构建了一个MASH模型，能够有效模拟该疾病的病理特征，并可用于药物筛选。这些发现不仅为细胞组织工程提供了新的策略，也为疾病建模和药物开发提供了可靠的平台。未来的研究应进一步探索水合结构与三维细胞自组织模式之间的关系，以实现更精确的细胞行为调控。