氧化铈纳米颗粒与氧化铁和甲氨蝶呤复合物的血管保护作用：在鼠模型中逆转动脉粥样硬化

《ACS Nano Medicine》：Vascular-Protective Effects of Cerium Oxide Nanoparticles Complexed with Iron Oxide and Methotrexate: Reversing Atherosclerosis in a Murine Model

动脉粥样硬化治疗新策略：壳聚糖稳定铁氧-铈氧纳米复合物（Chit-IOCO-Cy5-MTX）通过靶向巨噬细胞，同步实现MRI成像、ROS清除及抗炎治疗，显著减少斑块面积和炎症因子表达，动物实验证实安全有效。

　　动脉粥样硬化是一种影响动脉内层的复杂疾病，它会随着时间推移逐渐发展，是心血管疾病的主要诱因之一。该病的特征是慢性炎症和活性氧物质（ROS）的过度产生，而这些因素共同作用导致血管壁损伤和斑块形成。尽管在治疗方面取得了进展，但目前仍缺乏能够同时实现血管炎症可视化和调控的有效诊断与治疗策略。为了应对这一挑战，研究人员设计了一种以壳聚糖为稳定剂、结合甲氨蝶呤（MTX）和Cy5荧光染料的氧化铈-氧化铁纳米复合物（Chit-IOCO-Cy5-MTX），以实现ROS清除、抗炎活性以及磁共振成像（MRI）的双重功能。

该纳米复合物表现出强烈的T?弛豫特性（r?=281 mM?1s?1）和良好的胶体稳定性。在体外实验中，Chit-IOCO-Cy5-MTX能够被LPS激活的RAW 264.7巨噬细胞高效内化，显著降低细胞内的ROS水平，并抑制促炎性细胞因子（如IL-6、TNF-α和COX-2）的表达。在ApoE?/?小鼠模型中，MRI和离体荧光成像证实了纳米复合物在动脉粥样硬化斑块中的靶向富集。为期四周的治疗显著减少了斑块面积和炎症蛋白的表达，与生理盐水和未添加MTX的对照组相比，表现出更优的治疗效果，且未观察到明显的全身毒性。这些发现表明，该研究展示了一种基于氧化铈-氧化铁的纳米诊疗平台，能够实现对动脉粥样硬化中氧化和炎症通路的靶向成像与有效调控，突显了其在血管炎症疾病中的转化潜力。

在介绍部分，文章进一步探讨了动脉粥样硬化病理机制及其对心血管健康的影响。动脉粥样硬化的发展过程涉及多个阶段，从初始的炎症反应到斑块的形成和破裂，最终可能导致心肌梗死和中风等严重后果。炎症在动脉粥样硬化的各个阶段都起着关键作用，而ROS的过度产生也促进了氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）在血管中的积累，加剧了疾病进程。此外，ROS还可能通过刺激生长因子的分泌，如IL-6和TNF-α，进一步加重病情。同时，由诱导型一氧化氮合酶（iNOS）介导的自由基一氧化氮的过量生成，在炎症反应中也扮演了重要角色。而COX-2的表达，尤其是在与促炎性微粒体前列腺素E合成酶-1（mPGES-1）协同作用时，被认为是不稳定颈动脉粥样硬化斑块形成的关键酶。因此，针对炎症和氧化应激的治疗策略，成为调控动脉粥样硬化进程的重要方向。

研究中提出的纳米平台将治疗和诊断功能整合于一个系统，通过利用氧化铈的ROS清除和抗炎特性，以及MTX对激活巨噬细胞的靶向能力，为动脉粥样硬化的治疗提供了一种具有双重作用的高效策略。为了实现非侵入性的MRI追踪，氧化铈与氧化铁通过壳聚糖作为稳定基质进行电荷自组装，形成了Chit-IOCO纳米复合物。MRI作为广泛应用的成像技术，已成功用于多种疾病的诊断，包括动脉粥样硬化。而电荷自组装方法因其简便、经济性以及避免使用复杂设备和有害化学品，具有良好的可扩展性和可重复性，非常适合于商业化和临床应用。

为了进一步增强治疗效果，研究者在纳米复合物上偶联了MTX和Cy5荧光染料。MTX最初作为抗癌药物开发，现在广泛用于治疗类风湿性关节炎和许多其他慢性炎症性疾病。MTX的抗炎作用主要通过抑制嘧啶和嘌呤的合成，以及通过抑制多胺的生成和腺苷的释放实现。而类风湿性关节炎和动脉粥样硬化都是与巨噬细胞功能障碍和细胞因子（如TNFα、IL-1和IL-6）相关的炎症疾病。研究发现，MTX能够减轻类风湿性关节炎患者的动脉粥样硬化症状，并显著抑制胆固醇喂养兔子的动脉粥样硬化形成及相关基因表达。然而，Ridker等人的研究显示，低剂量MTX在稳定动脉粥样硬化患者中未能显著降低IL-1β、IL-6或C反应蛋白水平，也未能减少心血管事件。因此，采用纳米载体提高药物递送的精确性，以减少剂量同时保持治疗效果，成为这一研究的关键点。

在实验部分，研究者对纳米复合物进行了详细的合成与表征，包括其尺寸、Zeta电位和稳定性分析。Chit-IOCO纳米复合物的水动力学直径约为180纳米，Zeta电位为32.0毫伏，这归因于壳聚糖层的存在。通过EDS分析，纳米复合物中氧化铁和氧化铈的分布均匀。而在偶联Cy5和MTX后，纳米复合物的水动力学直径略有变化，保持在约160纳米，Zeta电位下降至19.2毫伏，表明Cy5和MTX的成功偶联。纳米复合物在水、生理盐水和含10%血清的生理盐水中表现出良好的稳定性，未观察到显著的聚集或降解现象。

进一步研究显示，Chit-IOCO-Cy5-MTX纳米复合物在体外实验中表现出更强的MRI对比效应。随着氧化铁浓度的增加，两种纳米复合物（Chit-IOCO和Chit-IOCO-Cy5-MTX）均导致T?加权MRI信号的减少，表明其作为T?对比剂的有效性。同时，Chit-IOCO-Cy5-MTX表现出更高的横向弛豫率（r?=281 mM?1s?1，r?*=938 mM?1s?1），相较于Chit-IOCO（r?=219 mM?1s?1，r?*=642 mM?1s?1）显示出更强的MRI对比能力。这表明MTX的偶联显著增强了纳米复合物的MRI性能，使其在检测动脉粥样硬化斑块方面具有更高的敏感性。

此外，MTX的偶联也提高了纳米复合物在细胞内的摄取效率。在体外实验中，Chit-IOCO-Cy5-MTX显示出比Chit-IOCO-Cy5更强的MRI T?信号和荧光强度，这表明MTX增强了纳米复合物对表达FR-β的巨噬细胞的靶向能力。这一发现进一步支持了MTX作为靶向配体在炎症相关疾病中的应用。然而，MTX的偶联也带来了一定的毒性问题，如在较高浓度下导致细胞活力下降。通过将MTX偶联到壳聚糖纳米载体上，研究者有效降低了其系统毒性，因为这种大分子结构可以防止MTX通过RFC被非特异性摄取，从而限制其在肝脏、肾脏和肠道等非靶向组织的分布。此外，MTX与壳聚糖的高分子量和大分子形式要求细胞进行内化和溶酶体处理才能释放药物，这在生理条件下（pH 7.4，37°C）可以显著减少MTX的细胞外释放，从而降低其对非靶向细胞的毒性。

在评估纳米复合物的生物相容性时，研究者进行了细胞活力、血液相容性等实验。结果显示，Chit-IOCO纳米复合物在0.06 μg/mL至10 μg/mL的浓度范围内对RAW264.7巨噬细胞的细胞活力没有显著影响。相比之下，Chit-IOCO-Cy5-MTX在0.5 μg/mL的浓度下导致细胞活力下降至81%，而在10 μg/mL的浓度下降至62%。这一现象可能与MTX的偶联导致巨噬细胞对纳米复合物的过度摄取有关，从而增加了细胞内的药物负荷，同时对促炎性细胞因子的抑制效果增强。此外，研究者还评估了纳米复合物对非吞噬性细胞（如CHO细胞）的毒性，发现其在较低浓度下未表现出显著的细胞毒性，进一步支持了纳米复合物对巨噬细胞的特异性作用。

在体外ROS清除和抗炎活性实验中，研究者观察到Chit-IOCO-Cy5-MTX在0.06 μg/mL或更高浓度的Ce下表现出显著的ROS清除能力。当Ce浓度超过0.25 μg/mL时，巨噬细胞内的ROS水平降至与未处理细胞相似的水平。在较高浓度的Chit-IOCO-Cy5-MTX（[Ce]高于2.5 μg/mL）下，其潜在的细胞毒性可能有助于进一步降低ROS水平。然而，在较低浓度（[Ce]低于0.5 μg/mL）下，Chit-IOCO-Cy5-MTX仍能有效清除ROS，表明其具有良好的治疗窗口。此外，与Chit-IOCO和Chit-IOCO-Cy5相比，Chit-IOCO-Cy5-MTX在相同Ce浓度下表现出更强的ROS清除能力。值得注意的是，MTX本身在体外实验中并未表现出ROS清除能力，说明其作用主要依赖于与壳聚糖的偶联，以增强其在巨噬细胞内的递送效率。

在体内实验中，研究者评估了Chit-IOCO-Cy5和Chit-IOCO-Cy5-MTX对动脉粥样硬化小鼠模型的治疗效果。研究发现，Chit-IOCO-Cy5-MTX在4周治疗后显著减少了斑块面积和炎症蛋白的表达，相较于生理盐水和未偶联MTX的对照组具有明显优势。此外，Chit-IOCO-Cy5-MTX在ApoE?/?小鼠的主动脉弓部位表现出显著的荧光信号增强，表明其在斑块中的有效富集。这进一步支持了Chit-IOCO-Cy5-MTX作为靶向成像和治疗剂的潜力。同时，MRI结果显示，Chit-IOCO-Cy5-MTX在ApoE?/?小鼠的颈总动脉斑块中表现出更强的T?*信号对比能力，表明其能够有效监测纳米颗粒的递送情况。

研究还发现，Chit-IOCO-Cy5-MTX在体内实验中显著减少了炎症蛋白（如IL-6、iNOS和COX-2）的表达，相较于其他MTX负载纳米颗粒表现出更高的治疗效果。这表明，通过将MTX偶联到壳聚糖纳米载体上，可以实现更低剂量下的高效治疗，从而降低系统毒性并提高治疗的精准度。此外，与之前的研究相比，Chit-IOCO-Cy5-MTX在较低浓度下（如1 mg/kg）表现出显著的斑块减少效果，相较于其他MTX相关纳米颗粒，显示出更强的治疗潜力。这表明，该纳米复合物在治疗动脉粥样硬化方面具有广阔的应用前景。

在讨论部分，研究者进一步探讨了Chit-IOCO-Cy5-MTX的潜在优势和局限性。首先，该纳米复合物在体内实验中表现出良好的生物相容性，对主要器官未造成显著的毒性影响，但仍需进一步研究其长期的生物分布、清除机制和潜在的系统毒性。其次，尽管MTX的偶联增强了其抗炎效果，但其对正常免疫细胞的广泛影响仍需进一步澄清。此外，目前的研究主要基于ApoE?/?小鼠模型，未来需要在其他预临床模型中进行验证，并与现有治疗药物（如他汀类药物或秋水仙碱）进行直接比较，以加强其转化相关性。未来的研究方向可能包括将该纳米平台与实时生物传感技术结合，以实现对动脉粥样硬化相关炎症生物标志物的持续监测。此外，采用微流控辅助合成方法，可提高纳米颗粒的制备精度和可扩展性，从而增强其临床转化潜力。最后，与其他药物递送纳米系统（如聚合物、脂质体或生物模拟载体）的比较研究，有助于明确氧化铈基纳米平台的相对优势，并为血管疾病的治疗提供更合理的优化方案。

综上所述，本研究提出了一种结合氧化铈、氧化铁和MTX的三重功能纳米复合物，用于动脉粥样硬化的治疗和诊断。这种纳米平台不仅能够有效清除ROS和抑制炎症反应，还能通过MRI实现斑块的可视化，具有重要的临床转化价值。尽管目前的研究仍基于小鼠模型，但其结果为未来的临床试验和实际应用提供了坚实的基础。未来的研究将聚焦于进一步优化纳米复合物的性能，包括提高其靶向性、降低毒性、增强体内稳定性和可扩展性，以期在临床实践中发挥更大的作用。