综述：中性粒细胞和中性粒细胞胞外诱捕网——癌症病理生理学和治疗耐药性中的双刃剑

《Cell Communication and Signaling》：Neutrophils and neutrophil extracellular traps: double-edged swords in cancer pathophysiology and therapy resistance

本综述系统阐述了中性粒细胞及其胞外诱捕网（NETs）在癌症中的双重角色。文章深入探讨了NETs的三种形成机制（裂解性、存活性和线粒体性）及其通过不同信号通路（如PAD4、ROS、NE/MPO）促进肿瘤发生、转移和治疗耐药性的机制。作者重点总结了NETs在塑造免疫抑制微环境、唤醒休眠肿瘤细胞及介导放化疗耐药中的关键作用，并展望了以PAD4、NE等为靶点的治疗策略，为克服癌症治疗挑战提供了新视角。

　　

中性粒细胞胞外诱捕网的形成及其与肿瘤细胞的相互作用

作为人体中最丰富的白细胞，中性粒细胞是抵御感染和损伤的首批响应者。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的形成是其一种独特的保护机制。NETs主要由染色质DNA镶嵌颗粒蛋白（如中性粒细胞弹性蛋白酶NE、髓过氧化物酶MPO）构成，最初被发现能捕获并杀死入侵的微生物。然而，在肿瘤背景下，NETs的释放成为一把双刃剑，深刻影响着癌症的进程。

NETs的形成机制复杂，取决于初始刺激物的不同。目前已知有三种主要形式：裂解性NETosis、存活型NETosis和线粒体NETosis。

在裂解性NETosis中，如PMA（佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯）刺激下，中性粒细胞通过激活PKC和RAF-MEK-ERK通路，导致NADPH氧化酶激活和活性氧（ROS）产生。同时，活化的肽酰精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）将组蛋白上的精氨酸残基转化为瓜氨酸，引起染色质解聚。NE和MPO随后易位至细胞核，促进染色质重塑，最终导致细胞膜破裂，释放出NETs。此过程依赖于NADPH氧化酶产生的ROS，并且Gasdermin D（GSDMD）的激活在其中扮演关键角色，其介导的细胞膜孔形成促使NETs释放。

相比之下，存活型NETosis则由金黄色葡萄球菌等病原体快速诱导（5-60分钟内）。此过程不依赖于NADPH氧化酶，也不导致细胞膜破裂。中性粒细胞通过囊泡分泌的方式释放被蛋白包裹的染色质，同时保留其迁移和吞噬功能。研究表明，体内活化血小板与中性粒细胞的结合可迅速诱导此类非裂解性NETs的形成。

第三种机制是线粒体NETosis，其主要释放线粒体DNA（mtDNA）而非核DNA。当受到钙离子内流或TLR（Toll样受体）连接等刺激时，线粒体ROS（mtROS）过度产生，导致线粒体膜通透性转换孔（mPTP）开放，从而将氧化的mtDNA-蛋白复合物挤出细胞外。该过程独立于核DNA解聚、NE和PAD4。

这三种NETs在癌症进展中扮演着不同的角色。裂解性NETs释放的大量蛋白酶（如MMP-9）和组蛋白可直接破坏细胞外基质（ECM），并通过作为损伤相关分子模式（DAMPs）激活TLR/NF-κB信号通路，促进肿瘤侵袭和转移。存活型NETs则通过持续释放NETs，捕获循环肿瘤细胞（CTCs），形成“预转移灶”，并维持慢性炎症环境，诱导上皮-间质转化（EMT）和免疫抑制。线粒体NETs富含的mtDNA能通过TLR9和cGAS-STING通路激活更强的炎症反应，并可能通过诱导I型干扰素（IFN-β）分泌促进免疫逃逸。

中性粒细胞的致癌作用

中性粒细胞通过驱动炎症病理过程促进癌症发生。研究表明，癌细胞分泌的因子可触发NETs形成，而NETs反过来通过诱导肿瘤细胞产生促炎反应（如COX2上调）来促进癌症转移。在黑色素瘤斑马鱼模型中，中性粒细胞被吸引至术后创伤的炎症部位，与癌前细胞相互作用，为其增殖创造条件。耗竭中性粒细胞可破坏化学诱导和自发癌症模型中的致癌效应。

此外，肿瘤相关中性粒细胞（TANs）还能诱导DNA损伤。除了释放具有基因毒性的ROS外，中性粒细胞还能释放携带促炎microRNAs（如miR-23a和miR-155）的颗粒，导致复制叉崩溃并抑制同源重组，增加DNA双链断裂和基因组不稳定性。这些microRNAs同时参与血管生成、免疫耐受等过程，是癌症进展的关键调节因子。

肿瘤微环境（TME）的不同组分如何影响NETs的组成和抗/促肿瘤特性？

TME的复杂组分，包括微生物群、癌症相关成纤维细胞（CAFs）和代谢产物（如乳酸），均能显著影响NETs的形成和功能。

微生物群，如病毒（EBV）和细菌（金黄色葡萄球菌），可通过TLR7/8或CXCL10-CXCR3轴等机制触发NETs释放。这些NETs可能干扰CD8⁺ T细胞和NK细胞的细胞毒性，形成物理屏障阻断免疫细胞浸润，从而促进肿瘤进展。肺部细菌感染诱导的NETs被证明是乳腺癌肺转移的关键负向调节因子，此过程受自噬调控。

CAFs通过分泌淀粉样蛋白β或FGF19等因子，刺激NETs形成。例如，FGF19通过FGFR4-JAK2-STAT3通路驱动肝星状细胞转化为炎症性CAFs（iCAFs），后者通过分泌补体C5a和IL-1β促进中性粒细胞招募和NETs生成，为结直肠癌肝转移创造有利环境。CAFs分泌的CXCL12还能上调中性粒细胞的PD-L1表达，抑制T细胞功能。

乳酸在癌症代谢重编程中的积累也是一个关键信号。酸性TME能延迟中性粒细胞凋亡，并促进其向N2表型（促肿瘤型）分化。这些TANs高表达β2整合素和CD11b/CD18，通过抑制T细胞、产生血管生成因子和分泌蛋白酶（如MMP-9）等方式促进癌症进展。

中性粒细胞和NETs在肿瘤转移中的作用

中性粒细胞和NETs通过多种机制影响转移级联反应的早期阶段，使癌细胞能够离开原发部位并迁移。

NETs能够唤醒休眠的肿瘤细胞并调节转移性增殖。研究表明，持续的肺部炎症导致NETs形成。NETs相关的蛋白酶NE和MMP9能依次切割层粘连蛋白。这种蛋白水解修饰后的层粘连蛋白通过整合素α3β1信号和FAK/ERK/MLCK/YAP通路触发休眠癌细胞的增殖。针对NET重塑层粘连蛋白的抑制性抗体可有效阻止休眠癌细胞被唤醒。此外，化疗药物如紫杉醇可通过损伤基质细胞释放IL-6和G-CSF，诱导中性粒细胞浸润并唤醒休眠肿瘤细胞。

NETs还能通过形成物理屏障来保护癌细胞免受免疫攻击。NETs包裹肿瘤细胞，损害CD8⁺ T细胞的细胞毒性，使肿瘤细胞无法与细胞毒性T淋巴细胞（CTL）直接接触。研究发现，NETs结构显著减少了肿瘤细胞与NK细胞和CD8⁺ T细胞的接触，抑制了免疫杀伤反应。在结直肠癌中，NETs通过癌细胞表面的CCDC25受体识别其DNA结构，捕获癌细胞并促进其肝转移。

促进预转移灶的形成是另一关键机制。中性粒细胞在乳腺癌和黑色素瘤肺转移前聚集于肺部，通过分泌多种细胞因子（如MMPs、VEGF、TGF-β和IL-17）增加血管生成环境，加剧免疫抑制，促进炎症，诱导血管生成和重塑细胞外基质。尼古丁等因子可通过STAT3信号通路招募N2中性粒细胞，促进预转移灶形成。

此外，NETs通过损伤血管完整性和促进EMT来促进转移。NETs相关蛋白酶可降解ECM，上调肿瘤细胞迁移能力，同时下调内皮细胞上的VE-钙粘蛋白表达，破坏血管完整性，促进肿瘤细胞 intravasation（内渗）。NETs还能增强EMT，赋予上皮源性细胞侵袭特性。

中性粒细胞和NETs在癌症治疗耐药性中的作用

中性粒细胞作为TME的核心组分，在癌症治疗耐药性中扮演关键角色，其作用在免疫治疗、化疗和放疗中均有体现。

在免疫治疗耐药方面，高水平的中性粒细胞浸润与较短的生存期和对免疫检查点抑制剂（ICI）的耐药相关。NETs能直接刺激T细胞耗竭，特别是CD8⁺ T细胞。例如，在肝细胞癌（HCC）模型中，CRKL过表达招募TANs，导致细胞毒性CD8⁺ T细胞耗竭和肿瘤内PD-L1⁺ TANs增加。NET-DNA与CD8⁺ T细胞上的TMCO6结合，可增强免疫治疗耐药性。此外，肿瘤细胞通过分泌G-CSF和GM-CSF等因子，上调中性粒细胞的抗凋亡蛋白Mcl-1，延长其生存期，使其转化为具有强免疫抑制功能的衰老CXCR4⁺中性粒细胞，促进免疫逃逸。

在化疗耐药方面，NETs是一个独立的危险因素。化疗药物如顺铂、紫杉醇和氟尿嘧啶可直接刺激中性粒细胞释放NETs。化疗后的癌细胞分泌IL-1β，进而触发NETs形成。NETs通过整合素αvβ1捕获潜伏的TGF-β，并通过MMP9切割和激活TGF-β。激活的TGF-β可诱导癌细胞发生EMT，从而赋予治疗耐药性。抑制MMP9可消除NET诱导的TGF-β激活和化疗耐药。

在放疗耐药方面，放疗可刺激中性粒细胞招募并诱导NETs形成。辐射诱导的NETs以中性粒细胞内在的方式阻碍免疫介导的细胞毒性。在膀胱癌模型中，放疗后癌细胞释放高迁移率族蛋白B1（HMGB1），通过TLR4信号介导NETs形成，导致放疗抵抗。使用NE抑制剂（NEI）或DNase 1可增强放疗疗效。

NETs组分对癌症发展的矛盾效应

NETs中的关键组分，如NE、MMP9、蛋白酶3（PR3）和组织蛋白酶G（CG），对癌症发展具有复杂且有时矛盾的影响。

中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）能通过细胞外反式激活膜受体（如EGFR和TLR4），触发MAPK级联激活，促进肿瘤增殖。NE还能进入肿瘤细胞降解胰岛素受体底物1（IRS-1），激活PI3K信号通路。然而，NE也被证明能通过切割癌细胞表面受体CD95，激活凋亡通路，选择性杀死癌细胞。

基质金属蛋白酶9（MMP9）通过降解胶原和基底膜促进新生血管形成、侵袭和转移。例如，在HCC中，CTNNB1功能获得性突变（GOF）通过下调SIRT2，促进β-连环蛋白/KDM4D复合物形成，进而转录激活MMP9。MMP9通过切割CD8⁺ T细胞表面的Slingshot蛋白磷酸酶1（SSH1），抑制其活化和迁移，导致免疫抑制微环境。

蛋白酶3（PR3）在乳腺癌肺转移中起重要作用。肿瘤分泌的组织蛋白酶C（CTSC）激活中性粒细胞膜结合的PR3，促进IL-1β加工和NF-κB激活，从而上调IL-6和CCL3以招募中性粒细胞。CTSC-PR3-IL-1β轴诱导中性粒细胞ROS产生和NETs形成，支持癌细胞在肺部的转移性生长。

组织蛋白酶G（CG）能以水解和非水解两种方式发挥作用。在水解模式下，CG降解ECM，促进侵袭。在非水解模式下，CG能激活血小板，促进其将主要组织相容性复合体（MHC）转移至肿瘤细胞，从而激活自然杀伤（NK）细胞，避免免疫逃逸。

抑制TANs形成和破坏肿瘤-中性粒细胞相互作用的策略

针对NETs和TANs的促瘤作用，多种靶向策略正在被探索。

抑制PAD4活性是重要方向。PAD4催化组蛋白瓜氨酸化，是NETs形成的核心酶。PAD4过表达与多种肿瘤相关。使用PAD4抑制剂（如CI-酰胺、GSK-484或BMS-P5）可显著抑制NETs释放，在多种癌症模型中延迟疾病进展，并与抗PD-1疗法产生协同效应。

靶向趋化因子通路，如CXCL1/CXCL8-CXCR1/CXCR2轴，可减少中性粒细胞招募和NETs形成。CXCR2对于将髓源性抑制细胞（MDSCs）招募至TME至关重要。抗CXCR2抗体可阻断MDSCs招募，改善患者反应。联合使用CXCR1/2抑制剂与免疫检查点疗法显示出显著效果。

调节TGF-β信号通路可影响TANs极化。TGF-β诱导TANs向N2表型（促肿瘤）分化，而抑制TGF-β信号可促进其向N1表型（抗肿瘤）转化。SMAD3抑制剂被确定为一种治疗策略，可在体内逆转肿瘤促进微环境为抗癌微环境。

此外，使用DNase I降解NETs中的DNA，或使用NE特异性抑制剂（如西维来司他），可直接破坏NETs结构，抑制其促进转移和治疗耐药的作用。

总结与展望

随着中性粒细胞和NETs在抗癌疗法疗效中的作用不断被揭示，各种靶向策略正在与现有抗癌治疗联合进行临床评估。然而，中性粒细胞具有高度异质性，不同的亚群可能对特定抗癌治疗结果产生独特甚至相反的影响。这种异质性也体现在NETs上，其既显示促瘤活性，也显示抗瘤活性。

本综述描述了不同信号通路调控的NETs形成在肿瘤进展和转移中的作用。为了克服肿瘤对传统药物的耐药性，必须综合考虑中性粒细胞和NETs在TME内的复杂调控机制和多重功能。尽管存在局限性，但针对NETs作为潜在癌症疗法的兴趣日益增长，为探索和改善癌症患者不良预后提供了一个非常有价值的方向。未来的研究需要阐明三种NETs在肿瘤中的时空分布和协同效应，并设计组合疗法以实现精准靶向。