丹皮酚通过靶向群体感应系统清除猪源大肠杆菌生物被膜的作用机制研究

《BMC Veterinary Research》：Paeonol eradicates biofilm in porcine-source Escherichia coli by targeting the quorum sensing system

本研究针对大肠杆菌生物被膜耐药性难题，首次系统揭示了天然活性化合物丹皮酚通过靶向OmpR调控QS系统、抑制鞭毛组装和EPS合成，有效清除猪源大肠杆菌成熟生物被膜的作用机制。研究综合运用DIA蛋白质组学、分子对接和CLSM等技术，为开发新型抗生物被膜制剂提供了理论依据。

　　

在抗生素耐药性日益严重的"后抗生素时代"，细菌生物被膜相关感染已成为临床治疗的重大挑战。特别是大肠杆菌作为养殖业主要病原体，其形成的生物被膜能通过群体感应(QS)协调群体行为和分泌细胞外多糖(EPS)构建保护性基质，使嵌入的细菌对抗生素产生高达千倍的耐药性。这一严峻现状迫切要求开发能够靶向破坏生物被膜结构的新型抗感染策略。

天然活性化合物因其生物相容性好、毒性低且不易诱导耐药性等优势，成为抗生物被膜研究的热点。丹皮酚作为一种从牡丹皮中提取的酚类化合物，前期研究表明其对肺炎克雷伯菌等病原体的生物被膜具有显著抑制作用，但其对猪源大肠杆菌生物被膜的具体作用机制尚不明确。

发表在《BMC Veterinary Research》的这项研究，首次系统阐明了丹皮酚清除猪源大肠杆菌Ec032菌株成熟生物被膜的分子机制。研究人员发现，丹皮酚在2048μg/mL浓度下处理3小时即可显著减少生物被膜内活菌数量，最高清除率达到58.31%。通过CLSM观察发现，丹皮酚处理后的生物被膜结构变得疏松，生物被膜生物量减少83.56%，体积减少98.01%。

关键技术方法

研究采用临床分离的猪源大肠杆菌Ec032菌株，通过结晶紫染色和菌落计数评估生物被膜清除效果；利用CLSM和Live/Dead染色分析生物被膜结构和细菌活性；采用RT-qPCR检测生物被膜相关基因表达；运用DIA蛋白质组学分析差异表达蛋白；通过分子对接验证丹皮酚与靶点蛋白结合能力；使用CV026报告菌株评价QS抑制活性。

丹皮酚对Ec032生物被膜生物量和活性的影响

研究发现丹皮酚对Ec032的最小抑菌浓度(MIC)大于2048μg/mL，表明其抗生物被膜作用不依赖于直接杀菌效应。时间梯度实验显示，丹皮酚在1-6小时内均能显著降低生物被膜生物量，其中3小时处理效果最佳。剂量依赖性实验证实2048μg/mL为最适作用浓度，更高浓度并未带来显著增效。

丹皮酚清除大肠杆菌生物被膜

CLSM三维成像显示，丹皮酚处理组生物被膜荧光强度显著降低，仅残留斑块状结构。BiofilmQ软件定量分析表明，丹皮酚使生物被膜基底面积减少7.29%，单位面积死菌和活菌荧光强度分别降低82.35%和93.54%，而单位体积荧光强度增加，提示剩余生物被膜区域内信号密度增强。

丹皮酚下调大多数生物被膜相关基因（mqsR除外）

RT-qPCR分析显示，丹皮酚显著下调QS相关基因(luxS、lsrK、qseB、qseC)，但意外上调mqsR表达。鞭毛相关基因(flhD、flhC、motA、motB、ycgR)和黏附相关基因(papG、csgA、csgB、csgD、bcsA)均被抑制，EPS合成基因wza同样表达下调。

DIA分析显示丹皮酚影响生物被膜相关蛋白表达

蛋白质组学鉴定出1001个差异表达蛋白，其中709个下调，292个上调。GO和KEGG富集分析表明，差异蛋白主要富集于鞭毛组装、群体感应和双组分系统(TCS)等通路。值得注意的是，鞭毛组装通路蛋白普遍下调，而丙酮酸代谢相关蛋白上调。

网络药理学揭示丹皮酚清除生物被膜的机制

PPI分析识别出35个核心靶点，其中OmpR、RpoS、FliC等蛋白构成关键调控网络。分子对接显示丹皮酚与OmpR结合能最强(-5.43 kcal/mol)，表明OmpR是其重要作用靶点。实验验证丹皮酚浓度依赖性抑制CV026菌株紫色素产生，证实其具有QS抑制活性，同时显著抑制细菌运动性和EPS合成。

研究结论与意义

本研究首次系统阐明了丹皮酚通过多靶点作用清除大肠杆菌生物被膜的分子机制。丹皮酚直接靶向OmpR调控蛋白，干扰QS信号传导，抑制AI-2介导的群体感应系统，同时下调鞭毛组装相关基因和蛋白表达，破坏细菌运动性和初始黏附。此外，丹皮酚还通过抑制EPS合成关键酶GcfE，减少胞外多糖含量，导致生物被膜结构疏松。

值得注意的是，丹皮酚还能诱导多重耐药蛋白MarA和外排泵蛋白AcrE/AcrF表达上调，这可能是细菌的一种应激补偿机制，但最终仍无法抵抗其抗生物被膜效果。研究还发现丹皮酚通过调控TqsA蛋白影响AI-2运输，促进AI-2外排而抑制内化，破坏QS信号平衡。

该研究为开发基于天然化合物的抗生物被膜策略提供了重要理论依据，丹皮酚作为一种有效的群体感应抑制剂，在对抗细菌耐药性方面展现出良好应用前景。然而，其体内有效性和临床适用性仍需进一步验证。