无保护剂冻存组织中RNA质量优化策略：解冻方法与组织分装尺寸对RNA完整性的影响

《BMC Biotechnology》：Optimizing RNA quality in cryopreserved tissues without preservatives: impact of preservatives, thawing methods and tissue aliquot sizes

本研究针对无保护剂冻存组织在冻融循环中RNA易降解的难题，系统评估了解冻温度（冰上/室温）、保护剂类型（RNALater/TRIzol/RL裂解液）、处理延迟时间、组织分装尺寸（70-300 mg）及冻融循环次数对兔肾组织RNA完整性（RIN）的影响。结果表明：冰上解冻结合RNALater处理可显著维持小样本（≤100 mg）的RNA质量（RIN≥8），而大样本（250-300 mg）更适合-20°C过夜解冻；RNALater能在7天内有效保护RNA稳定性。该研究为生物样本库中珍贵冻存样本的标准化处理提供了关键技术支持。

　　

在生物医学研究领域，高质量的RNA是确保基因表达分析、微阵列杂交和下一代测序等下游实验结果可靠性的基石。尽管液氮（LN）速冻技术能通过瞬间达到-150°C以下的玻璃化温度有效抑制RNase（核糖核酸酶）活性，但冻存组织在反复冻融过程中仍面临RNA降解的严峻挑战。尤其对于生物样本库中大量以无保护剂形式保存的珍贵档案组织，如何在部分取样时维持剩余样本的RNA质量，成为制约资源高效利用的瓶颈。传统标准操作流程推荐的组织分装尺寸（0.5-1 g）与商业RNA提取试剂盒的优化输入量（≤30 mg）不匹配，导致实际操作中需进行液氮研磨或解冻后分割，进一步增加了RNA降解风险。虽然RNALater、TRIzol等保护剂对新鲜组织效果显著，但其对冻存档案组织的挽救效果尚不明确。

为破解这一难题，武汉大学中南医院的研究团队在《BMC Biotechnology》发表论文，系统探究了影响无保护剂冻存组织RNA质量的关键因素。研究人员以兔肾组织为模型，通过控制解冻温度、保护剂类型、处理延迟、组织分装尺寸及冻融循环次数等变量，结合人源和小鼠肾组织验证实验，建立了一套优化的工作流程。

关键技术方法包括：使用液氮预冷研钵将冻存组织粉碎成10-300 mg不同规格分装；分别采用RNALater、TRIzol和RL裂解液作为保护剂，在冰上或室温条件下解冻；通过高通量组织研磨仪（TissueLyser）进行均质化处理；利用HiPure Total RNA Mini Kit提取RNA，并通过NanoDrop One spectrophotometer和Agilent 4200 TapeStation系统评估RNA浓度、纯度及RIN值；实验还涉及从武汉大学中南医院认证生物样本库获取的冻存2-5年的人肾组织及小鼠肾组织进行验证。

解冻温度和保护剂的影响

研究团队比较了冰上解冻（15分钟）与室温解冻（10分钟）条件下，未处理组与三种保护剂（RL裂解液、RNALater、TRIzol）处理组的RNA质量。所有样本均显示高纯度（A_260/280≈2.10）。保护剂处理样本在冰上解冻时RIN显著高于室温解冻组（p<0.01）。其中RNALater组表现最优，100%样本达到RIN≥8，显著优于RL裂解液组（16.7% RIN≥8）和TRIzol组（16.7% RIN≥8）。TRIzol组在不同解冻温度下均呈现较低RNA产量。

处理延迟时间的评估

将RNALater处理的10-30 mg组织分装置于冰上保存15分钟至7天，发现RIN在1天内保持高度稳定。尽管120分钟组与7天组存在统计学差异（9.38±0.10 vs. 8.45±0.44），所有延迟处理样本均维持测序级质量阈值（RIN≥8）。RNA产量无时间依赖性变化（p=0.14），证明RNALater能有效保护RNA稳定性。

组织分装尺寸的效应

研究人员将组织分为70-100 mg、100-150 mg和250-300 mg三组，分别采用冰上过夜解冻和-20°C过夜解冻。对于≤100 mg组织，两种解冻方式均能维持较高RIN（≥7）；而250-300 mg大样本在冰上解冻时RIN显著低于-20°C解冻组（5.25±0.24 vs. 7.13±0.69）。结果表明小分装尺寸更利于RNA保存，大样本更适合-20°C缓融。

冻融循环的纵向影响

对同一组织块进行3-5次冻融循环实验发现，-20°C解冻组（尤其是大样本）RIN波动显著。70-100 mg组织经3次冻融后RIN无显著下降，但250-300 mg组织在5次循环后出现降解，显示反复冻融对大样本影响更显著。

人源与小鼠肾组织验证

在冻存多年的人肾组织中，除70-100 mg冰上解冻组RIN显著低于液氮研磨对照组（5.42±0.78 vs. 7.76±0.54）外，其余处理组无统计学差异，但整体RIN较动物组织偏低。而10-30 mg小鼠肾组织在所有解冻条件下均维持RIN≥8，证实RNALater对小型动物组织保护效果稳定，同时揭示种间差异对保护剂效率的影响。

该研究结论明确：对于无保护剂冻存的档案组织，RNALater结合冰上解冻能最优保护≤100 mg样本的RNA完整性；>100 mg样本建议采用-20°C解冻或液氮粉碎后处理；冻融循环应严格控制。讨论部分强调，RNALater在兔、鼠等动物组织中效果显著，但在人肾组织中保护效率有所下降，可能与种间RNase活性差异、组织区域异质性有关。研究为生物样本库的标准化操作提供了关键参数，尤其为珍贵临床样本的多次利用提供了可行方案。未来需进一步探索混合保护剂或高效RNase抑制剂在人类多器官冻存组织中的应用潜力。