基于尿液代谢组学的糖尿病肾病与非糖尿病肾病鉴别标志物L-酪氨酸的发现与验证

《BMC Nephrology》：Analysis of potential biomarkers for diabetic kidney disease and non-diabetic kidney disease based on urinary metabolomics analysis

本研究针对糖尿病肾病(DKD)与非糖尿病肾病(NDRD)临床鉴别诊断困难的问题，通过尿液非靶向代谢组学筛选出18种差异代谢物，并采用靶向代谢组学验证发现L-酪氨酸在DKD患者尿液中显著下调。该生物标志物为DKD与NDRD的无创鉴别诊断提供了新思路，对改善患者预后具有重要意义。

　　

在全球糖尿病患病率持续攀升的背景下，糖尿病肾病(DKD)作为糖尿病最严重的微血管并发症之一，已成为终末期肾病(ESRD)的主要病因。令人担忧的是，20%-40%的糖尿病患者会发展为DKD，而部分患者实际上患有非糖尿病肾病(NDRD)或DKD与NDRD共存的情况。这两种疾病的治疗策略和预后截然不同：NDRD患者对糖皮质激素和免疫抑制剂治疗反应良好，肾功能可能显著改善；而DKD目前缺乏特异性治疗方法，主要依靠控制血糖、血压和血脂来延缓疾病进展。

临床实践中，DKD与NDRD的鉴别诊断面临巨大挑战。肾穿刺活检虽然是金标准，但其侵入性操作可能引起血肿、血尿等并发症，尤其对于DKD患者风险更高。当前非侵入性诊断方法主要依赖临床表现综合判断，如蛋白尿、肾小球滤过率(GFR)和糖尿病视网膜病变(DR)等，但敏感性和特异性均不足。因此，开发可靠的无创鉴别诊断方法成为临床迫切需求。

在这一背景下，研究人员将目光投向了代谢组学这一新兴技术。代谢组学能够全面分析生物体内代谢物谱，揭示生理或病理过程中的代谢变化，为疾病诊断和机制研究提供新视角。本研究创新性地采用尿液代谢组学方法，探索DKD与NDRD之间的代谢差异，旨在发现具有鉴别诊断价值的生物标志物。

研究人员采用了两阶段研究设计：首先通过非靶向代谢组学筛选差异代谢物，然后利用靶向代谢组学进行验证。关键技术方法包括：1)收集匹配的DKD和NDRD患者尿液样本建立研究队列；2)采用超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)技术进行非靶向代谢组学分析；3)运用多元统计分析和受试者工作特征(ROC)曲线筛选潜在生物标志物；4)通过靶向代谢组学对候选标志物进行定量验证。

Untargeted metabolomics Cohort characteristics

研究共纳入68例DKD患者和63例NDRD患者，通过性别、年龄和体重指数(BMI)匹配后，每组选择10例进行非靶向代谢组学分析。如表1所示，两组患者在基础临床特征上匹配良好，但在反映疾病特征的关键指标上存在显著差异：DKD组的血清肌酐(Scr)、血糖(GLU)水平显著高于NDRD组，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和尿肌酐(Ucr)水平则显著降低，这些差异与两种疾病的病理生理特征一致。

Total sample principal component analysis

主成分分析(PCA)结果显示，在正负离子模式下，DKD组与NDRD组均呈现分离趋势，但未能完全分离。值得注意的是，NDRD组的样本分布比DKD组更为分散，这反映了NDRD包含多种病理类型的异质性特点，而DKD是相对单一的疾病类型。

Partial least squares discrimination analysis

偏最小二乘判别分析(PLS-DA)作为一种有监督的判别分析方法，能够更好地揭示组间差异。模型验证参数R²和Q²接近1，且置换检验显示模型未过拟合。PLS-DA得分图显示DKD组与NDRD组在正负离子模式下均存在明显分离，表明两组间的代谢谱存在显著差异。

Differential metabolite analysis

火山图分析共鉴定出212种差异代谢物，其中正离子模式105种(76种上调，29种下调)，负离子模式107种(18种上调，89种下调)。通过ROC曲线分析(AUC≥0.7)、Pearson相关性分析及与肾功能指标的相关性评估，最终筛选出18种具有潜在诊断价值的代谢物。

KEGG enrichment pathway analysis

KEGG通路富集分析揭示了DKD与NDRD之间最相关的代谢通路，包括嘧啶代谢、β-丙氨酸代谢、氨基酰-tRNA生物合成、胆固醇代谢和苯丙氨酸代谢等。这些通路主要涉及氨基酸和核苷酸代谢，表明DKD患者存在广泛的代谢紊乱。

Targeted metabolomics validation

Verification cohort characteristics using targeted metabolomics

为了验证非靶向代谢组学结果，研究人员建立了独立的验证队列，包括20例DKD患者和20例NDRD患者。如表4所示，验证队列在性别、年龄和BMI方面匹配良好，且在与疾病特征相关的关键临床指标上表现出与发现队列一致的差异模式。

Quantitative analysis of amino acids

靶向代谢组学对23种氨基酸进行定量分析，结果显示13种氨基酸存在统计学差异。值得注意的是，L-酪氨酸是唯一在DKD组中显著下调的氨基酸(p<0.05)，这一趋势与非靶向代谢组学结果完全一致。其他12种氨基酸(包括L-天冬氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸等)在DKD组中均表现为上调，进一步凸显了L-酪氨酸的特异性变化模式。

Discussion

本研究通过系统的代谢组学分析，首次发现并验证了尿液中L-酪氨酸作为DKD与NDRD鉴别诊断的潜在生物标志物。L-酪氨酸在DKD患者尿液中显著下调的现象在非靶向和靶向代谢组学中均得到证实，表明这一发现具有较高的可靠性。

从功能角度分析，L-酪氨酸不仅参与氨基酰-tRNA生物合成，还是儿茶酚胺类神经递质(去甲肾上腺素、肾上腺素和多巴胺)的前体物质，这些物质在调节胰岛素抵抗和分泌中发挥重要作用。已有研究表明，低水平的L-酪氨酸会增加T2DM患者发生DR的风险，而肾功能不全会进一步增加这种风险。DR和DKD同为糖尿病的微血管并发症，且具有强相关性，因此尿液中L-酪氨酸排泄减少可能反映了导致DKD发病的全身性代谢改变。

与其他差异代谢物相比，L-酪氨酸的优势在于其变化趋势在两种代谢组学分析中高度一致，且与肾脏功能指标具有显著相关性。这些特征使其具备成为临床鉴别诊断标志物的潜力。

研究的创新之处在于采用了两阶段验证策略，先通过非靶向代谢组学广泛筛选，再通过靶向代谢组学精准验证，提高了结果的可靠性。此外，研究严格控制了混杂因素，确保两组患者在基础特征上匹配良好，增强了结论的说服力。

然而，本研究也存在一定局限性。样本量相对较小，且来自单中心，结果的普适性需要更大规模的多中心研究进一步验证。此外，L-酪氨酸在DKD发病中的具体机制尚不明确，需要后续实验研究深入探索。

综上所述，本研究通过尿液代谢组学分析发现L-酪氨酸是区分DKD与NDRD的潜在生物标志物，为这两种疾病的非侵入性鉴别诊断提供了新方向。这一发现不仅具有临床诊断价值，也为理解DKD的代谢机制提供了重要线索。未来研究应着重探索L-酪氨酸在DKD发病中的具体作用机制，并验证其在大规模人群中的诊断效能，最终推动其在临床实践中的应用。