Oryzalin诱导的Borago officinalis多倍体现象通过免疫荧光显微镜技术揭示了细胞壁的重塑过程

《Frontiers in Plant Science》：Oryzalin-induced polyploidy in Borago officinalis reveals cell-wall remodelling via immunofluorescence microscopy

通过化学诱导多倍体化技术，研究向日葵（Borago officinalis）四倍体的形态与细胞结构变化，发现四倍体叶片增厚、气孔变大密度降低、表皮增厚、维管束扩大及细胞壁重组（JIM5、JIM7、LM5荧光强度差异显著），为植物代谢工程和次生代谢产物提升提供理论基础。

　　人工多倍体化是一种强有力的生物技术手段，用于提升药用植物的形态和生理特性。本研究探讨了通过化学诱导实现整个基因组重复在紫草（*Borago officinalis* L.）中的影响。研究通过使用一种名为Oryzalin的化学物质，在体外诱导多倍体化，并通过流式细胞术验证了多倍体和稳定四倍体亚克隆的形成。随后，选择部分四倍体样本进行形态学、解剖学和细胞特征的分析，利用光学显微镜和共聚焦显微镜，以及通过免疫荧光标记技术观察了细胞壁中果胶表位（包括均一果胶素和鼠李糖果胶I）的分布情况。

实验结果显示，与二倍体相比，四倍体表现出更厚、更深绿色的叶片，以及更高的腺毛密度和独特的生长习性。显微镜观察发现，四倍体的气孔显著增大，密度降低，同时维管束结构扩大，叶肉组织的排列也发生了变化。免疫荧光分析进一步揭示了四倍体组织中细胞壁重塑的独特模式。这些发现不仅揭示了基因组剂量变化在紫草中的结构和组织化学影响，还展示了化学诱导多倍体化在增强农业和药用特性方面的潜力。这项研究为未来在植物代谢工程和分子制药中的应用奠定了基础。

在方法部分，研究首先使用来自SEMORO（捷克共和国）的种子培育了紫草的植物材料。由于紫草不被划分为特定品种或育种系，因此没有适用的品种标识。选取的供体植物是强壮的、无病害的，并且在标准温室条件下培养。为了最大化体外萌发并避免休眠，研究人员在完全分果前收集果实，并仅选择生理上未成熟、外果皮柔软而非硬化的小坚果作为材料。从这些小坚果中，研究人员剥离了接近完全形成但仍未成熟的合子胚，作为起始材料进行体外培养。

体外培养方法采用的是改进的Murashige和Skoog培养基（MSvdSM），其区别在于使用了螯合铁源（FeEDDHA替代FeSO4/Na2EDTA），以提供更稳定和可利用的铁。培养基中加入了30克/升的蔗糖、8克/升的琼脂、20毫克/升的抗坏血酸（ASC）、0.01毫克/升的吲哚-3-丁酸（IBA）和0.01毫克/升的6-苄基腺嘌呤（BA），以及0.1%的Plant Preservative Mixture（PPM）。抗坏血酸的加入是为了减少体外培养过程中的氧化应激和多酚褐变，与之前关于抗坏血酸在植物组织培养中的使用报告一致。培养基的pH值调整至5.8后进行高压灭菌处理。

在Oryzalin处理过程中，研究人员选择了八个种子衍生的基因型（编号1、3、7、18、21、24、25、27）进行处理，这些基因型基于其健康状况、预培养期间的存活能力和持续微繁殖能力被预先选定。每个基因型使用30个节段进行实验，另外使用10个节段作为对照。Oryzalin的浓度设定为20微摩尔，这是基于之前的体外实验在* Astragalus membranaceus*中得出的最优平衡，既保证了存活率，又提高了四倍体化效率。Oryzalin被直接加入培养基后进行高压灭菌处理，培养过程在恒温箱中进行，温度控制在22±2°C，光照周期为16小时，光照强度保持在32到36微摩尔/平方米/秒之间。经过两周的培养后，实验组被转移到不含Oryzalin的MSvdSM培养基中继续生长，每个试管中仅放置一个节段。从腋芽中再生的每株植物都被视为一个独立的亚克隆。

为了验证四倍体的形成，研究人员使用流式细胞术分析了各亚克隆的倍性水平。通过将样本叶片组织与内部标准（*Pisum sativum* cv. Ctirad，2C=8.76皮克DNA）进行比较，确认了四倍体和混合多倍体的形成。在分析过程中，研究人员对至少3000个细胞核进行了相对荧光强度的测量，使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）进行染色，并利用Partec CyFlow ML设备进行分析。数据使用FloMax软件版本2.9进行处理，确保了分析的准确性和可靠性。实验结果显示，共获得108个再生亚克隆，其中13个为混合多倍体，6个为稳定四倍体。这些结果为后续的形态和组织化学分析提供了基础。

在转移至体外条件的过程中，只有来自克隆24和7的亚克隆被成功转移。其中包括两个对照线（24C和7C）以及三个四倍体亚克隆（24/5、24/7和24/13）。这些亚克隆通过MSvdSM培养基进行生根处理，培养基中添加了生长素（IAA、NAA和IBA，浓度均为2毫克/升）和抗坏血酸。随后，植物在无菌的珍珠岩中逐渐适应，并最终移植到生长箱中进行生长。尽管四倍体亚克隆的适应成功率略低于对照组，但总体上它们展示了稳健的生长和稳定的表型，表明该方法适用于四倍体和对照组的体外适应。

在四倍体线中，形态学变化显著。例如，24C和24/7表现出直立且分枝的生长习性，而24/13则呈现类似莲座状的结构，叶片间距紧密。在叶片形态方面，24C和24/7的叶片呈现狭长且边缘平滑，而24/13的叶片则更宽且边缘具有明显的锯齿状。四倍体叶片还表现出更高的腺毛密度，这与后续的腺毛评估结果一致。这些变化表明，基因组重复显著增强了紫草中腺毛的形成和发育，进而导致叶片表面更加粗糙。

在组织学分析方面，研究人员使用光学显微镜和共聚焦显微镜对叶片和叶柄的横截面进行了详细观察。紫草叶片的结构在二倍体和四倍体中具有典型特征，包括表皮层中的腺毛和非腺毛，以及在叶柄中发现的不均匀加厚的厚壁细胞，这些细胞提供了弹性。主维管束位于叶柄的近轴侧，而韧皮部位于远轴侧，两者之间有形成层细胞。在叶片的栅状组织和海绵组织中，可以观察到明显的差异，特别是24/13的海绵组织比24C更紧凑，这与其较低的海绵组织厚度相一致。在叶柄的横截面中，四倍体表现出更大的总横截面积，以及更发达的维管束结构，其中木质部的导管细胞面积增加，形成层区域更为明显。

免疫组织化学分析进一步揭示了细胞壁成分的分布变化。研究人员使用了多种抗体，包括JIM5（识别低甲基化果胶）、JIM7（识别高甲基化果胶）、LM5（识别RG-I的半乳糖侧链）和LM6（识别阿拉伯糖）、LM2和JIM13（识别阿拉伯半乳糖蛋白）。在叶片的近轴表皮和远轴表皮中，四倍体显示出显著增强的JIM5信号，其中24/13的信号最强。JIM7在近轴表皮和叶肉层中均显示出增强的信号，特别是在24/13中。在叶柄的主维管束中，JIM7的信号强度在四倍体中显著增加，但24/7和24/13之间没有明显差异。在叶柄的厚壁细胞中，24/7表现出最强的LM5信号，而24/13的信号则较弱。这些变化表明，四倍体化可能增强了RG-I的半乳糖侧链，尤其是在承重和光合作用组织中，而维管束的信号则相对稳定。

研究还发现，四倍体的叶片在多种组织中表现出显著的LM5信号增强，包括叶片的近轴和远轴表皮、栅状组织和叶柄的厚壁细胞。这些信号的变化表明，四倍体化可能通过调节RG-I的半乳糖侧链来影响细胞壁的机械性能。相比之下，LM6和AGPs（如LM2和JIM13）未在叶片样本中检测到显著信号，这可能与它们在细胞壁中的分布有关。

这些研究结果表明，通过化学诱导实现的四倍体化在紫草中引发了显著的组织学和细胞壁成分变化。四倍体的叶片不仅在形态上表现出更大的尺寸和更密集的腺毛，还在结构上显示出更厚的表皮层和更发达的维管束系统。这些变化可能对植物的生理功能和药用特性产生深远影响，特别是在提高生物活性化合物的积累方面。此外，四倍体的叶片在机械性能和水分利用效率方面也可能具有优势，这为未来在药用植物中的应用提供了新的思路。

综上所述，本研究通过系统的方法展示了四倍体化对紫草的多方面影响，不仅限于外观上的变化，还包括内部结构和细胞壁成分的调整。这些发现为理解基因组剂量变化在植物中的作用提供了重要的基础，并为未来的生物技术和药理学研究开辟了新的方向。