与液-液相分离相关的基因风险模型揭示了结直肠癌的预后特征及肿瘤微环境特性

《Journal of Cell Communication and Signaling》：Risk model of liquid–liquid phase separation-related genes reveals the prognosis and tumor microenvironment characteristics of colorectal cancer

液液相分离（LLPS）在结直肠癌（CRC）进展中起关键作用，本研究基于TCGA数据构建了首个基于LLPS相关基因的风险模型，发现ASXL1、DDX21、HNRNPA1L2、TACC3和TRIM28五个基因对CRC预后有显著预测价值。模型显示高风险组患者生存率更低，并与更高的肿瘤突变负担、免疫检查点表达上调及对Entinostat敏感性增加相关。单细胞测序和体外实验证实了这些基因在调控细胞增殖、迁移及免疫微环境中的核心作用。LLPS作为分子组织中心在CRC恶性转化中的机制值得深入探索。

　　本研究探讨了结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）进展过程中液-液相分离（Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS）的作用，以及其在预测疾病预后和开发精准治疗策略中的潜在价值。作为消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，CRC在全世界范围内对人类健康构成了严重威胁。根据2020年的全球癌症数据，CRC位列第三大常见癌症，并且是癌症相关死亡的第二大原因，每年导致超过90万例死亡。尽管目前已有多种治疗方法，如手术、化疗、放疗和免疫治疗，但CRC的进展速度往往较快，特别是在晚期或转移性病例中，治疗效果有限，患者生存率和生活质量均较低。因此，理解CRC的发病机制、开发早期诊断技术以及寻找更具准确性的早期诊断标志物成为当前研究的重点。

近年来，液-液相分离作为一种新兴的生物学现象，引起了科学界的广泛关注。它通过形成无膜细胞器（如核仁、应激颗粒等），在时间和空间上调控基因表达、信号转导和细胞功能。研究表明，异常的相分离与肿瘤的发生和发展密切相关，并已被证实参与了多种细胞内生物学过程。例如，53BP1的凝聚状态可以被多种长链非编码RNA（lncRNA）调控，从而影响DNA损伤修复。此外，环状GMP-AMP合成酶（cGAS）与双链DNA的结合会诱导cGAS-DNA凝聚体的相分离，从而形成独特的生化微环境，促进DNA感知和下游信号通路的激活。相分离还在肿瘤代谢异质性中扮演了重要角色，代谢酶（如ACLY、PKM2）可以通过相分离形成代谢微区，动态调控致癌代谢物（如乙酰辅酶A和α-酮戊二酸）的局部浓度，从而影响组蛋白修饰和细胞增殖。这种“表观遗传-代谢-剪接”网络的相分离耦合，可能为CRC的靶向治疗提供突破。因此，研究其如何整合多层级调控网络以推动肿瘤的恶性转化，将为开发以相分离为靶点的精准治疗策略提供理论依据。

为了深入研究LLPS在CRC中的作用，本研究首先从The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库中获取了702例CRC患者的RNA测序数据，并通过“limma”软件包进行差异表达分析。结果表明，共有3671个基因表现出显著差异表达，其中2486个基因在肿瘤组织中上调，1185个基因下调。随后，我们利用GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）进行了功能富集分析，发现这些差异表达基因主要富集于与细胞周期、细胞因子和脂肪代谢相关的生物学功能。这为后续分析提供了重要的基础。

基于上述差异表达基因，我们进一步筛选出与LLPS相关的32个基因，包括27个上调基因和5个下调基因。为了构建一个具有预测能力的模型，我们使用了“glmnet”软件包进行LASSO分析，最终确定了五个最具预测价值的基因：ASXL1、DDX21、HNRNPA1L2、TACC3和TRIM28。通过计算每位患者的综合风险评分，我们将CRC患者分为高风险和低风险两个亚组。结果显示，高风险患者预后较差，其总体生存率（Overall Survival, OS）明显低于低风险患者。此外，通过ROC曲线分析，我们发现该模型在预测CRC患者的1年、3年和5年生存率方面具有较高的准确性，这表明所构建的LLPS相关基因风险模型在临床应用中具有重要价值。

为了验证该模型的稳健性，我们进一步将其应用于GSE72968这一独立验证数据集。结果表明，模型在预测生存率方面依然表现出色，且在两个数据集中均能有效区分高风险和低风险患者。同时，该模型在临床特征与风险评分之间展现了良好的独立预测能力，其中性别、年龄、临床分期和LLPS相关基因表达均被证实为独立的预后指标。为了增强模型的临床适用性，我们构建了一个包含性别、年龄、临床分期和风险评分的列线图（Nomogram），该工具能够准确预测CRC患者的1年、3年和5年生存概率。校准曲线进一步验证了该模型的预测能力，显示其预测的生存概率与实际结果高度吻合。

此外，我们还分析了这五个关键基因与CRC亚型之间的关系。通过与CMS（Consensus Molecular Subtypes）分类的结合，我们发现这些基因在不同的分子亚型中表现出显著的亚型特异性。例如，在CMS2和CMS4亚型中，ASXL1、DDX21和HNRNPA1L2的表达水平较高，而在CMS1亚型中，TACC3的表达水平显著上升。这表明，这些LLPS驱动基因可能在不同的分子亚型中发挥不同的作用。值得注意的是，风险评分仅在CMS2亚型中表现出显著的独立预后价值，这提示LLPS可能在这一特定亚型中发挥核心作用，成为推动其恶性进展的关键分子机制。因此，针对CMS2亚型患者，调控这些关键基因的相分离能力可能成为一种具有前景的治疗策略。

在免疫微环境分析方面，我们发现高风险CRC患者中，免疫细胞的浸润程度较低，包括CD8+ T细胞和自然杀伤（NK）细胞。这表明高风险患者可能处于免疫抑制状态，其肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）的免疫功能受到抑制，从而影响患者的预后。与之相对，低风险患者则表现出更强的免疫反应，这可能与他们较高的DNA修复能力和较低的肿瘤纯度有关。此外，我们还分析了不同风险组之间对免疫检查点抑制剂（Immune Checkpoint Inhibitors, ICIs）的潜在反应。结果显示，高风险组的大多数免疫检查点分子均被上调，表明他们可能对ICIs具有较好的响应。然而，高风险组的免疫相关通路（如免疫检查点、促炎反应和T细胞共刺激）却表现出较低的活动性，这可能限制了ICIs的治疗效果。因此，针对高风险患者的治疗可能需要结合其他策略，以增强T细胞的浸润和免疫应答。

在药物敏感性分析方面，我们发现高风险组对Entinostat的敏感性更高，这可能与ASXL1和TRIM28介导的表观遗传调控异常有关。相反，低风险组对5-氟尿嘧啶（5-Fu）表现出更高的敏感性，这可能与他们相对完整的DNA修复机制有关。这些发现强调了基于风险分层的治疗策略在CRC中的重要性，为个体化治疗提供了新的思路。

进一步的蛋白质结构分析表明，这五个关键基因均具有内在无序区域（Intrinsically Disordered Regions, IDRs），这是LLPS蛋白的重要特征。通过STRING数据库分析它们的蛋白质相互作用网络，我们发现这些基因在RNA剪接和染色质修饰方面表现出显著的功能富集。这表明，这些基因可能通过形成动态的无膜细胞器，调控转录和转录后过程，从而影响细胞功能。例如，DDX21可以与剪接因子形成共凝聚体，调控致癌性RNA亚型；而ASXL1和TRIM28则可能通过形成相分离枢纽，招募表观遗传修饰因子，改变CRC的染色质可及性。这些动态凝聚体的形成可能成为潜在的治疗靶点，通过干预其相分离过程，可以调节致癌性RNA剪接和表观遗传修饰，从而影响肿瘤进展。

在细胞定位分析方面，我们利用单细胞测序技术研究了这五个关键基因在不同细胞类型中的表达模式。结果显示，ASXL1和TACC3主要在T细胞中表达，这可能表明它们在调节CRC免疫微环境方面具有重要作用。DDX21和TRIM28则在几乎所有的细胞类型中均表现出较高的表达水平，而HNRNPA1L2则在上皮细胞中表达较低，可能在维持其分化状态中发挥作用。这些发现不仅揭示了基因表达的空间分布特征，也为理解其在肿瘤发生发展中的作用提供了新的视角。

通过体外实验，我们进一步验证了DDX21和TRIM28在CRC进展中的功能。实验结果显示，这两个基因在CRC细胞中高表达，并且它们的沉默显著抑制了细胞的增殖和迁移能力。这些结果实验性地证明了DDX21和TRIM28作为风险基因在CRC中的重要性。同时，我们还发现，这些基因的表达水平与CRC的免疫微环境、突变负荷和药物敏感性密切相关，为个体化治疗提供了新的依据。

综上所述，本研究首次构建了基于LLPS相关基因的CRC预后风险模型，并对其潜在功能、免疫浸润、突变特征和药物敏感性进行了深入分析。该模型不仅扩展了我们对CRC分子机制的理解，还为基于LLPS的精准治疗策略提供了新的方向。通过调控这些关键基因的相分离能力，可以干预肿瘤进展，提高患者预后。此外，本研究还揭示了LLPS在CRC中的亚型特异性作用，表明其在CMS2亚型中具有显著的预后价值。这些发现为未来开发针对LLPS的靶向治疗策略奠定了理论基础，同时也为CRC的早期诊断和个体化治疗提供了新的研究思路。