基于基因组学和免疫信息学的分析：一种源自牛的布鲁氏菌S19野毒株的适应性变化及其对疫苗效果的影响

《Veterinary Medicine and Science》：Genomic and Immunoinformatics Insights Into a Bovine-Derived Brucella abortus S19 Field Strain: Adaptations Impacting Vaccine Efficacy

本研究通过比较基因组学和免疫信息学分析，揭示了牛流产杆菌S19疫苗株在土耳其Erzurum地区分离的场地方言株BAS19与参考株BAR19的基因组变异，包括1153 SNPs、120插入和2501缺失，并探讨了这些变异对毒力因子和免疫原性的影响，为改进疫苗设计提供了依据。

　　Brucella abortus S19 是一种广泛使用的活疫苗株，用于控制牛布鲁氏菌病的传播。然而，这种疫苗的长期效果受到了其基因组可塑性和适应机制的挑战。本文对从土耳其埃尔祖鲁姆地区一头被接种过 Brucella abortus S19 后3年发生流产的牛胎盘中分离出的场株 BAS19 进行了全面的基因组比较和免疫信息学分析。通过 Oxford Nanopore Technology（ONT）进行全基因组测序，随后进行了基因组组装、功能注释和与参考株 BAR19 的比较分析。研究发现 BAS19 相较于 BAR19，存在1153个单核苷酸多态性（SNPs）、120个插入和2501个缺失。功能注释揭示了 BAS19 中有772个假定蛋白，而 BAR19 中只有604个。在与宿主相互作用相关的毒力基因方面也存在显著差异。对95个外膜蛋白（OMPs）的免疫信息学分析显示，其中47个蛋白出现了抗原表位的丢失，11个蛋白则出现了新的抗原表位。β-桶结构预测表明，BAS19 中有9个 OMPs 失去了 β-桶结构，这可能影响宿主与病原体之间的相互作用。这些发现突显了 BAS19 在基因组适应性方面的重要性，这些适应性可能影响其免疫原性和疫苗效果。研究结果有助于更深入地理解 Brucella abortus 的基因组多样性，为区域流行病学需求量身定制的改进疫苗和治疗策略提供了见解。

在研究方法部分，BAS19 的场株被分离出来，然后在血液琼脂平板上培养，随后在液体培养基中进行扩增，以获得足够的基因组DNA（gDNA）用于提取。通过 ZymoBIOMICS DNA MiniPrep Kit 进行了 gDNA 提取，并使用 Nanodrop 2000 分光光度计测量了 DNA 纯度，确保 260/280 比值 ≥1.8。DNA 浓度通过 Qubit High Sensitivity 2.0 dsDNA 测定法精确测量。高质量的 gDNA 为全基因组测序（WGS）和后续的生物信息学分析提供了基础。

为了进行全基因组测序，使用了 ONT SQK-LSK109 测序试剂盒。提取的 gDNA 经过 3′ 和 5′ 端修复，使用 NEBNext Ultra II End Prep 酶混合物和 NEBNext FFPE DNA 修复混合物处理，然后用 AMPure XP 球珠纯化。通过 Quick T4 DNA 连接酶将测序接头连接到 DNA 上。随后按照 ONT SQK-109 协议完成了文库制备。测序过程在 MinION 设备上进行，使用 Flowcell v9.4.1，生成的原始数据以 FAST5 格式存储，用于基因组组装和注释分析。为了提高测序效率，DNA 浓度根据 Qubit 高灵敏度测定法优化至 10 ng/μL 的截止值。这些数据随后用于基因组注释和变异分析。

在计算分析部分，BAS19 的基因组数据经过 MinKNOW 接口进行碱基调用，并转换为 FASTQ 格式。使用 FASTQC 评估序列质量和过滤低质量的读取，确保 Q-score ≥10 的高置信度数据选择。长读序列随后通过 Flye v2.8.3 进行处理，这是一种专门为长读测序技术优化的组装器，能够确保复杂重复区域的高准确性。通过 N50 指标（≥50,000 bp）评估了组装质量，并维持了至少 50× 的最小测序深度以消除低覆盖率区域。最终的高质量基因组组装为后续的功能基因组分析做好了准备。

基因预测和注释方面，使用了 RASTtk（Rapid Annotation using Subsystem Technology）工具。RASTtk 通过利用一个广泛的参考数据库来预测基因功能。使用 Glimmer 预测编码序列（CDS），该工具采用基于马尔可夫模型的算法，准确检测开放阅读框（ORFs）≥100 bp，从而减少假阳性。转移RNA（tRNA）编码基因则通过 tRNAscan-SE 工具检测。注释结果被提交至 GenBank（SRR14268008）用于进一步的基因组分析。

变异检测部分，BAS19 基因组与参考基因组 BAR19（NC_010742.1 ChrI 和 NC_010740.1 ChrII）进行比对，使用 Minimap2 进行比对。比对数据通过 SAMtools 和 bcftools 处理，识别了包括 SNPs、插入和缺失（INDELs）以及移码突变在内的遗传变异，并将其存储为 VCF 格式。在 RStudio 中对检测到的变异进行了功能注释，以阐明这些突变的生物学意义，特别是它们对毒力因子的影响。

基因组比较分析揭示了 BAS19 和 BAR19 之间的进化关系和遗传差异。参考基因组序列从 NCBI RefSeq 数据库中获取，确保分析的可靠性。通过 GenVar 识别了遗传变异，允许对 SNPs、INDELs 和移码突变进行详细表征。此外，使用 ORF Finder 进行了 ORF 预测，以研究这些变异对基因功能的影响。

毒力因子的鉴定方面，查询了 PATRIC 平台上的 VFDB（Virulence Factor Database），该数据库包含与毒力相关的蛋白质信息。通过比较 BAS 和 BAR 基因组，识别了缺陷的细菌毒力因子，这些因子在宿主-病原体相互作用中起着关键作用。这一分析提供了两种菌株之间潜在的病原机制改变的见解。

外膜蛋白（OMPs）和 β-桶结构的预测分析表明，OMPs 在增强免疫反应方面起着重要作用，特别是在 Brucella abortus 疫苗中。在 BAS19 的基因组注释后，通过将获得的 GenBank 数据与参考数据库中的蛋白质进行比较，分析了这些蛋白质。参考蛋白质来自 UniProt 数据库（条目号 430066）。在 BAS 基因组中筛选出了 95 个 OMPs，并对这些蛋白质进行了比较分析。

细菌抗原的鉴定和信号肽分析显示，选择了 30 个与毒力相关的蛋白质作为潜在抗原候选。使用 Clustal Omega 进行了多重序列比对，以评估其分泌潜力。通过 SignalP 6.0 预测了信号肽的存在，从而评估这些蛋白质在 BoLA 类 I 和 II 抗原呈递途径中的作用，帮助识别免疫原性靶点。这种方法促进了 BAS 和 BAR 菌株之间的全面免疫学比较。

对于细菌 OMPs 的 B 和 T 细胞表位预测，分析了先前阶段识别的蛋白质，并与参考数据进行比较，以评估相关 INDEL 或 SNP 变化对免疫反应的潜在影响。在牛中，主要组织相容性复合体（MHC）被称为牛白细胞抗原（BoLA），因此 BoLA 类 I 和 II 对应于 MHC 类 I 和 II 分子。为了识别免疫主导表位，使用了 BepiPred-2.0 和 ABCpred 预测 B 细胞表位。BepiPred-2.0 使用了 0.5 的阈值进行表位预测，而 ABCpred 基于人工神经网络，分析了 16 个氨基酸序列窗口以识别潜在抗原决定簇。T 细胞表位预测使用了 NetBoLApan-I 和 NetBoLApan-II，这两者是专门针对牛 BoLA 抗原呈递的。预测的表位被映射到 BoLA I 和 BoLA II 分子上，以分类为适应性免疫反应的潜在靶点。BAS 与 BAR 菌株之间的比较免疫学分析有助于评估表位的丢失或获得，这可能影响宿主免疫识别和病原体的致病性。鉴于 BoLA-DRB3 等位基因在牛免疫中的重要性，特别关注了表位变化对免疫逃避和疫苗设计的影响。

研究结果表明，BAS19 的基因组长度为 3,282,271 bp，而 BAR19 的基因组长度为 3,278,307 bp。BAS19 的 GC 含量为 57.22%，与 BAR19 相同。没有观察到质粒含量的差异。关于基因组长度，BAS19 的长度为 3,282,271 bp，而 BAR19 的长度为 3,278,307 bp。L50 值为 1，表明两种菌株都具有较高的遗传完整性。然而，N50 值分别为 2,121,058 bp 和 2,121,359 bp，显示出基因组的完整性。ORF 的数量分别为 4482 和 3291，表明 BAS19 拥有更多 ORF。此外，BAS19 含有 89 个重复区域，而 BAR19 含有 90 个。假定蛋白的数量分别为 772 和 604，显示了 BAS19 与 BAR19 在假定蛋白、ORF 数量和重复区域方面的显著基因组差异。

在免疫表位预测方面，研究显示 BAS19 的 OMPs 中有 61.05% 的蛋白质发生了表位变化，其中 49.47% 的蛋白质出现了表位丢失，11.58% 的蛋白质出现了新的表位。其余 38.95% 的蛋白质未发生表位变化，表明这些结构在进化上更加稳定。ABCpred 分析显示所有蛋白质都发生了表位变化，没有蛋白质保持不变。总体来看，48 个蛋白质（50.53%）出现了表位丢失，而 47 个蛋白质（49.47%）则获得了新的表位。这些变化可能影响宿主免疫识别和病原体的致病性。考虑到 BoLA-DRB3 等位基因在牛免疫中的重要性，特别关注了表位变化对免疫逃避和疫苗设计的影响。

研究结果表明，BAS19 在毒力因子方面比 BAR19 更丰富，具体而言，BAR19 包含 128 个毒力因子，而 BAS19 包含 169 个毒力因子。这些毒力因子的变化可能影响病原体的致病机制和宿主-病原体相互作用。此外，BAS19 的某些基因长度发生了变化，如 cp24 增加了 17.74%，Omp25 增加了 2.04%，Omp31 增加了 3.51%。其他基因如 asp24、Glyoxalase 和 Glutaredoxin 也出现了显著的长度变化。而某些基因如 Omp19 和 VjbR 则未发生长度变化，表明这些蛋白质保留了其核心毒力功能。

通过对 BAS19 和 BAR19 的比较分析，研究发现了一些关键的毒力因子和基因组变化。这些变化可能影响细菌的致病性，同时影响其与宿主的相互作用。此外，某些基因如 groEL、AsnC、P39、Bfr、DnaK、Omp16、RibH、SodC、Tig 和 exsA 的长度发生了显著变化，这些变化可能与细菌的适应性相关。研究还发现了一些基因如 Omp25 和 Omp31 的长度增加，这些变化可能增强了细菌的免疫逃逸能力。

通过 BepiPred-2.0 和 ABCpred 的分析，发现 BAS19 中有 47 个蛋白质出现了表位丢失，11 个蛋白质获得了新的表位。这些表位变化可能影响宿主对细菌的免疫识别，进而影响疫苗的有效性。此外，BAS19 中某些蛋白质的 β-桶结构预测显示，其 β-桶结构比例从 BAR19 的 34.7% 降低到 24.2%，这可能影响细菌的免疫逃逸能力。某些蛋白质如 BAbS19_I00090、BAbS19_I09030、BAbS19_II02220、BAbS19_II10320 等失去了 β-桶结构，这可能影响其与宿主的相互作用。

研究还揭示了 BAS19 和 BAR19 在毒力因子和免疫原性方面的显著差异。这些差异可能影响疫苗的有效性，并为改进疫苗设计和开发更精确的治疗策略提供重要线索。BAS19 的免疫原性变化可能对其在宿主中的生存和传播产生影响，而这些变化也可能是其在长期接种后仍然存在感染和流产现象的原因之一。

综上所述，该研究通过整合全基因组测序、基因组比较和免疫信息学方法，全面分析了 BAS19 的基因组结构、毒力因子和免疫原性。研究结果为理解宿主-病原体相互作用提供了重要信息，并为开发新一代疫苗和免疫治疗策略奠定了基础。这些发现不仅有助于揭示 Brucella abortus 的进化动态，也为疫苗和治疗策略的改进提供了科学依据。