PFGE-SBT-MLVA-WGS多技术联用揭示日本广岛军团病暴发溯源及ST2398/ST2399新基因型进化特征

《International Journal of Medical Informatics》：A large outbreak investigation of Legionnaires’ disease associated with a public bath facility in Hiroshima, Japan, using PFGE, SBT, MLVA, and whole-genome sequencing

本文推荐研究人员针对2017年日本广岛公共浴场暴发的军团病大规模疫情（58例患者），通过PFGE、SBT、MLVA和全基因组测序(WGS)等多技术联用，首次发现ST2398和ST2399新基因型为致病源，证实浴场循环系统1为传染源，并揭示患者存在不同基因簇共感染现象，为军团菌暴发调查提供了多重菌株分离和突变累积分析的新范式。

　　

在温泉文化盛行的日本，公共浴场本是民众放松身心的场所，却可能成为致命病原体的传播温床。2017年3月，日本广岛县突发一起大规模军团病疫情，短短20天内导致58人感染，其中1人死亡，引发公共卫生部门的高度警觉。军团菌病是由军团菌属细菌引起的感染性疾病，其中嗜肺军团菌血清群1型是近90%病例的元凶。这类细菌广泛存在于自然水体和人造水系统中，通过气溶胶传播，对老年人及免疫功能低下者威胁尤甚。

尽管日本已将军团菌病列为第四类法定传染病，但病例数仍逐年攀升，2017年报告病例达1733例。虽然多数病例为感染源不明的散发病例，但公共浴场已被确认为日本军团菌病的主要感染源。此前已有多次浴场相关疫情报道，然而大规模暴发的精准溯源和传播机制解析仍存在挑战。传统分子分型方法如脉冲场凝胶电泳(PFGE)和序列分型(SBT)虽可用于菌株区分，但对密切相关的基因型分辨力有限，难以揭示暴发菌株的微进化关系和传播动态。

在此背景下，广岛县立技术研究所公共卫生与环境中心的研究团队对此次暴发展开了深入调查。他们创新性地整合了PFGE、SBT、多位点可变数目串联重复分析(MLVA)和全基因组测序(WGS)四种技术，对从患者和浴场环境分离的94株嗜肺军团菌进行了系统分析，研究成果发表于《International Journal of Medical Informatics》。

关键技术方法包括：从22名患者和浴场七个循环系统采集样本进行细菌分离培养；使用PFGE、SBT和MLVA-12进行初步基因分型；选取32株代表菌株进行WGS，通过BactSNP进行单核苷酸变异(SNV)分析，利用Gubbins去除重组区域，构建系统发育树和单倍型网络。

3.1. 患者特征

58名患者中79%为男性，中位年龄69岁，全部出现肺炎症状，97%有发热表现。诊断主要依靠尿抗原检测(78%)，仅22名患者分离到菌株。

3.2. 公共浴场为感染源

浴场设有七个独立循环系统，仅系统1检出与患者匹配的血清群1型菌株。该系统配备气泡发生器，可能促进气溶胶传播，且菌浓度达110 CFU/100mL。

3.3. 嗜肺军团菌分离株的分子分型

PFGE将菌株分为PF-01A、PF-01B和PF-01C三种模式。SBT鉴定出ST2398和ST2399两个新序列型，二者仅相差两个等位基因(pilE和neuA)。MLVA进一步将菌株细分为八个基因型，与PFGE和SBT结果高度一致。

3.4. 基于WGS的SNV系统发育树

SNV分析显示ST2398和ST2399仅相差30-42个SNV，属于高度同源的遗传谱系。单倍型网络分析发现环境菌株与患者菌株仅差0-3个SNV，确认了传播链。至少三名患者同时感染ST2398和ST2399两种基因型。

研究结论表明，此次暴发由浴场循环系统1中的ST2398和ST2399新基因型引起，这些菌株均携带毒力基因lag-1。值得注意的是，ST2398可能由ST2399在浴场环境中长期进化而来。多基因型共感染现象提示，暴发调查时需从单一样本分离多株菌株，以全面评估环境中的突变累积和混合感染风险。

该研究的意义在于建立了多技术联用的暴发调查新模式，揭示了军团菌在人工水系统中的微进化规律。WGS技术的应用突破了传统分型方法的局限，为未来疫情溯源提供了高分辨率工具。研究强调，在公共卫生实践中，需关注浴场等高风险环境的微生物监测，完善军团菌病的防控策略。