微流控辅助制备ARV 825与奥希替尼共载脂质体用于结直肠癌治疗的潜力探索

《International Journal of Pharmaceutics》：Microfluidic-assisted preparation of ARV 825 and Osimertinib loaded liposomal formulation as a potential system for colorectal cancer therapy

本研究针对结直肠癌（CRC）治疗中因EGFR和BRD4过表达导致的耐药性与脱靶毒性难题，开发了基于3D打印微流控T型芯片的ARV 825（ARV）与奥希替尼（OSI）共载脂质体（AROSIB）。该制剂粒径均一（~200 nm）、包封率高（ARV ~75%，OSI ~98%），在体外二维/三维肿瘤模型中显著增强抗癌活性，为克服CRC耐药性提供了新策略。

　　

在全球癌症负担中，结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）的威胁始终居高不下，其发病率和死亡率常年位居前列。当患者被确诊时，往往已处于癌症晚期，这给治疗带来了极大的挑战。目前，手术、化疗和放疗是应对CRC的常规手段，但它们犹如一把双刃剑：在攻击肿瘤细胞的同时，也常常误伤健康组织，导致严重的脱靶毒性。更棘手的是，肿瘤细胞非常“狡猾”，它们会逐渐对化疗药物（如常用的5-氟尿嘧啶）产生耐药性，使得治疗效果大打折扣。科学家们一直在寻找更精准的打击目标，希望能“擒贼先擒王”。在CRC中，表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR）和溴结构域蛋白4（Bromodomain-containing protein 4, BRD4）这两个分子靶点尤为引人注目。超过85%的CRC病例中存在EGFR的过度表达，它像是一个失控的加速踏板，不断驱动着肿瘤细胞的增殖和转移。奥希替尼（Osimertinib, OSI）作为第三代EGFR抑制剂，能有效踩下这个“刹车”。而BRD4则是另一个“帮凶”，它能促进肿瘤进展。传统的BRD4抑制剂在临床上面临耐药困境，于是，一类名为蛋白降解靶向联合体（PROteolysis TArgeting Chimera, PROTAC）的新武器应运而生。ARV 825（ARV）正是这样一种PROTAC分子，它能巧妙地引导细胞自身的“垃圾处理系统”（E3泛素连接酶）去降解BRD4蛋白，从而从根源上清除这个致癌因子。理论上，同时使用OSI抑制EGFR信号通路，并用ARV降解BRD4蛋白，双管齐下，有望产生协同效应，更有效地抑制肿瘤，并能降低各自所需的剂量，减少副作用。然而，理想很丰满，现实却很骨感。OSI和ARV都面临着一个共同的“先天不足”——水溶性差、生物利用度低，这严重限制了它们的疗效发挥。这就好比拥有了精良的武器，却缺乏有效的投送系统。为了解决这一难题，并探索协同靶向EGFR和BRD4的治疗策略，来自圣约翰大学的研究团队在《International Journal of Pharmaceutics》上发表了一项创新研究。他们利用先进的微流控技术，成功制备了能同时装载ARV和OSI的脂质体纳米制剂（AROSIB），并系统评估了其特性及抗癌效果。

为开展本研究，研究人员主要采用了以下几个关键技术方法：首先，利用熔融沉积建模（FDM）技术的3D打印机定制了聚丙烯微流控T型结芯片，作为脂质体制备的核心装置。其次，通过微流控技术快速混合脂质乙醇溶液与水性相，自发形成包载双药的脂质体（AROSIB）。在表征方面，运用动态光散射（DLS）测定纳米粒子的粒径和分布，高效液相色谱（HPLC）分析药物包封率，并借助冷冻透射电子显微镜（Cryo-TEM）直观观察脂质体的形态和大小。此外，研究还利用了人结直肠癌细胞系（如HCT 116和HT 29）的二维培养模型和三维肿瘤球体模型进行体外药效评估，并通过溶血试验考察了制剂的血液相容性。

材料

研究所需的ARV 825和奥希替尼（OSI）分别购自Musechem和MedChem Express公司。制备脂质体所用的磷脂材料包括1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）、胆固醇以及1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG²⁰⁰⁰），均购自Lipoid公司。其他溶剂如HPLC级水、乙腈、无水乙醇等来自Fisher Scientific。

Development and characterization of AROSIB using microfluidics technology

研究人员利用3D打印的微流控T型结芯片成功制备了共载ARV和OSI的脂质体 formulation (AROSIB)。表征结果显示，AROSIB具有均一的纳米粒径（约200 nm），最优的多分散指数（约0.150），并且对两种药物均表现出高包封效率，其中ARV约为75%，OSI高达约98%。在4°C下储存28天的稳定性试验表明，AROSIB能保持良好的稳定性。冷冻透射电镜结果进一步证实了其典型的脂质体形态和尺寸。

Conclusion

总结而言，本研究证实了共靶向BRD4和EGFR通路在应对结直肠癌关键增殖和生存机制方面的临床相关性。新型的3D打印微流控辅助脂质体 formulation (AROSIB) 实现了对ARV和OSI的精确共包封，产生了具有优化药物比例的稳定纳米载体。体外实验表明，该组合具有强大的协同抗癌效应；在二维细胞培养实验和三维肿瘤球体模型中，均显示出显著的细胞毒性作用、诱导凋亡能力，并能有效抑制癌细胞迁移和克隆形成存活。此外，AROSIB还表现出良好的血液相容性。研究表明，3D打印的T型结芯片可成为脂质体制备的一种有前景的替代方案。通过微流控技术辅助在脂质体 formulation 中共递送ARV和OSI，代表了一种通过同时靶向EGFR和BRD4来克服耐药性和增强CRC治疗效果的引人注目的方法。

CRediT authorship contribution statement

作者贡献声明如下：Akanksha Patea负责概念化、调查、方法论、验证、形式分析及初稿撰写；Mattia Tiboni和Luca Casettari参与概念化、资源提供及审稿编辑；Ketan Patel负责监督、资源提供、资金获取、概念化及审稿编辑。

Declaration of competing interest

作者声明不存在任何可能影响本工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

Acknowledgements

本工作获得了美国纽约州皇后区圣约翰大学药学院与健康科学学院的支持。作者感谢CUNY高级科学研究中心成像中心提供的Cryo-TEM仪器分析支持。资金来源于欧盟下一代EU计划，Mission 4, Component 2，由意大利大学与研究部（MUR）国家创新生态系统资助（授权号ECS00000041 - VITALITY – CUP H33C22000430006）。

归纳研究结论和讨论部分，本研究成功开发了一种基于微流控技术的新型脂质体纳米平台（AROSIB），用于协同递送PROTAC分子ARV 825和EGFR抑制剂奥希替尼，以应对结直肠癌治疗中的耐药性和药物递送挑战。该制剂展现了优异的理化特性、稳定性和体外抗癌功效。其重要意义在于：第一，验证了同时靶向EGFR和BRD4通路在CRC治疗中的协同潜力；第二，展示了3D打印微流控技术在制备复杂纳米药物（如共载脂质体）方面的巨大优势，包括精确控制、可重复性和潜在的可放大性；第三，为克服PROTACs和小分子抑制剂固有的溶解性和递送难题提供了有效的纳米技术解决方案。这项研究为开发更高效、更精准的CRC联合疗法奠定了坚实的基础，预示着纳米医学在攻克肿瘤耐药性方面具有广阔的应用前景。