环状RNA FCHO2通过调控PTBP1核转位抑制GRN前体mRNA剪接促进COPD气道重塑的机制研究

《Cell Death & Disease》：Circular RNA FCHO2 promotes airway remodeling in COPD via regulating nuclear translocation of PTBP1 to repress the splicing of GRN pre-mRNA

本刊推荐：为阐明慢性阻塞性肺疾病(COPD)气道重塑机制，研究人员聚焦环状RNA circFCHO2的功能研究。发现circFCHO2通过结合剪接因子PTBP1促进其核转位，抑制GRN前体mRNA剪接，降低PGRN蛋白表达，激活NF-κB通路，最终驱动气道上皮细胞上皮-间质转化(EMT)和细胞外基质(ECM)重塑。该研究为COPD治疗提供了新的潜在靶点。

　　

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种以持续性气流受限为特征的常见慢性呼吸系统疾病，全球患病人数高达3亿，已成为世界第三大死因。尽管吸入性糖皮质激素(ICS)等标准疗法可缓解部分症状，但目前尚无能够逆转COPD病理改变的有效治疗手段。气道重塑和肺气肿是COPD的核心病理特征，其中气道上皮细胞的上皮-间质转化(EMT)和细胞外基质(ECM)重塑是驱动气道结构异常的关键机制。近年来，环状RNA(circRNA)作为一类具有共价闭合环状结构的非编码RNA分子，因其结构稳定性和重要调控功能而成为疾病研究的新热点。然而，circRNA在COPD发病过程中的具体作用机制尚不明确。

为深入探索circRNA在COPD气道重塑中的作用，研究人员通过分析多个COPD相关RNA测序数据集，筛选出15个共同差异表达的circRNA。其中，保守的哺乳动物circRNA circFCHO2在COPD细胞模型、小鼠模型和患者肺组织中表达显著上调，且在香烟烟雾提取物(CSE)处理的支气管上皮细胞BEAS-2B中呈现浓度依赖性增加。通过反向剪接位点验证、RNase R消化实验和荧光原位杂交(FISH)等技术，研究人员确认了circFCHO2的环状结构和主要胞质定位。

功能研究表明，circFCHO2过表达可促进BEAS-2B细胞发生EMT（表现为E-钙黏蛋白下调，N-钙黏蛋白和α-SMA上调）和ECM重塑（MMP2/MMP9上调，TIMP1下调），并增强细胞对失巢凋亡的抵抗能力。相反，circFCHO2敲低则逆转这些表型。机制探索发现，circFCHO2并非通过miRNA海绵或编码蛋白发挥作用，而是与RNA结合蛋白PTBP1直接相互作用。RNA pulldown和RNA免疫共沉淀(RIP)实验证实，circFCHO2通过其AU富集基序（特别是motif 1）与PTBP1的RRM1、RRM2和RRM3结构域结合，促进PTBP1的核转位。

进一步通过RIP-seq和RNA-seq联合分析，研究人员筛选出148个受circFCHO2-PTBP1轴调控的下游靶基因，其中GRN（颗粒蛋白前体基因）最为显著。circFCHO2过表达增加PTBP1与GRN前体mRNA的结合，抑制其剪接成熟，导致成熟GRN mRNA和PGRN蛋白表达下降，而circFCHO2敲低则呈现相反效果。ELISA检测发现circFCHO2同样调控PGRN的分泌水平。

PGRN作为多功能糖蛋白，可通过与肿瘤坏死因子受体(TNFR)结合抑制NF-κB信号通路活化。实验证实，circFCHO2通过下调PGRN激活NF-κB通路（p-IκBα和p-p65水平升高），而PGRN过表达可逆转circFCHO2诱导的NF-κB活化及EMT/ECM重塑表型。在体实验中，通过气管注射AAV-circFCHO2-shRNA敲低COPD模型小鼠肺组织circFCHO2表达，可显著改善肺功能参数（FEV_0.2/FVC%、MMF、PEF），减轻肺泡隔破坏和小气道上皮增厚，逆转胶原沉积和EMT/ECM重塑相关蛋白表达异常。

主要技术方法包括：临床样本采集（16例非恶性肺结节患者组织）、香烟烟雾暴露小鼠模型构建、细胞培养与慢病毒转染、RNA测序与生物信息学分析、RNA pulldown与质谱鉴定、免疫共沉淀、Western blot、免疫荧光、免疫组化、ELISA、肺功能检测和组织病理学分析等。

研究结果部分：

circFCHO2作为保守的哺乳动物circRNA与COPD相关：通过三个COPD相关RNA测序数据集(GSE221812、GSE268499、GSE198740)筛选出15个共同差异表达circRNA，其中circFCHO2在CSE处理的BEAS-2B细胞中上调最显著（约2.5倍）。其在COPD患者和小鼠肺组织中表达升高，经PCR、Sanger测序和RNase R实验验证为环状结构，主要定位于细胞质。

circFCHO2促进支气管上皮细胞EMT和ECM重塑：基因集富集分析(GSEA)显示circFCHO2调控基因显著富集于细胞粘附和凋亡通路。Western blot和免疫荧光证实circFCHO2过表达诱导EMT和ECM重塑表型，降低细胞-ECM粘附，增强失巢凋亡抵抗；而敲低则呈现相反效果。TUNEL染色和Annexin V/PI流式检测进一步验证其对凋亡的调控作用。

circFCHO2与PTBP1相互作用并调控其核质分布：RNA pulldown联合质谱鉴定发现PTBP1是circFCHO2的结合蛋白，RIP实验验证其在人和小鼠中的保守性。circFCHO2不影响PTBP1表达量，但通过基序1与PTBP1的RRM结构域（特别是RRM2）结合，促进PTBP1核转位。

circFCHO2抑制PTBP1介导的GRN mRNA前体剪接：RIP-seq与RNA-seq整合分析鉴定出148个共同靶基因，GRN是其中受调控最显著的基因。circFCHO2过表达增加PTBP1与GRN前体mRNA结合，抑制其剪接成熟，降低PGRN表达和分泌；在COPD细胞模型和患者样本中PGRN表达上调。

circFCHO2通过降低PGRN水平激活NF-κB信号通路促进EMT和ECM重塑：PGRN过表达抑制NF-κB通路活化（p-IκBα和p-p65水平降低），而circFCHO2通过下调PGRN激活NF-κB。PGRN过表达可逆转circFCHO2诱导的EMT、ECM重塑、细胞粘附下降和失巢凋亡抵抗等表型。

circFCHO2敲低逆转香烟烟雾诱导的小鼠肺气肿和气道重塑：AAV介导的circFCHO2敲低可改善COPD小鼠肺功能，减轻肺泡破坏和小气道重塑，上调PGRN表达，缓解EMT和ECM重塑。

本研究首次揭示了circFCHO2-PTBP1-PGRN轴在COPD气道重塑中的关键作用。circFCHO2通过调控PTBP1的亚细胞定位，影响GRN前体mRNA剪接效率，进而调节PGRN表达和NF-κB信号通路活性，最终驱动EMT和ECM重塑。该发现不仅深化了对circRNA在COPD中作用机制的理解，也为开发以circFCHO2为靶点的COPD治疗策略提供了理论依据。值得注意的是，PGRN在不同疾病背景下的双重功能提示其调控网络的复杂性，未来研究需进一步探索circFCHO2-PTBP1轴在COPD炎症微环境中的其他潜在作用。该研究发表于《Cell Death and Disease》杂志，为COPD的精准治疗提供了新的分子靶点和思路。