Hippo-YAP信号通路通过诱导FHL3表达促进肝细胞癌进展的新机制

《Cell Death & Disease》：The Hippo-YAP signaling pathway promotes hepatocellular carcinoma progression by inducing FHL3 expression

本刊推荐：为阐明Hippo-YAP信号通路在肝细胞癌(HCC)中的促癌机制，研究人员通过自发水动力肿瘤模型筛选出关键靶点FHL3。研究发现FHL3通过招募MAZ转录因子结合KRAS启动子G-四链体(G4s)结构，激活KRAS转录及其下游致癌信号通路。该研究揭示了Hippo-YAP-FHL3-MAZ-KRAS信号轴在HCC进展中的重要作用，为Hippo通路异常激活的HCC患者提供了新的诊断和治疗靶点。

　　

在全球范围内，肝癌是导致癌症相关死亡的第三大常见原因，其中肝细胞癌(HCC)占所有肝癌病例的约90%。肝细胞癌的病理生理过程复杂，涉及多种遗传易感性因素、病毒与非病毒危险因素的相互作用、肿瘤微环境等。尽管在肝癌治疗方面取得了一定进展，但患者预后仍然较差，这迫切需要深入探索肝癌发生发展的分子机制。

Hippo信号通路作为进化上保守的重要通路，在调控细胞增殖、分化和组织稳态中发挥关键作用。该通路的核心效应分子YAP/TAZ在多种实体瘤中异常高表达，约30%的肝细胞癌患者存在Hippo通路激酶级联失活和YAP高活性。然而，YAP在肝细胞癌中的具体促癌机制尚未完全阐明，识别其下游关键靶基因对于开发新的治疗策略至关重要。

在这项发表于《Cell Death and Disease》的研究中，研究人员通过构建YAP参与的自发水动力肿瘤模型，结合生物信息学分析，筛选出Hippo-YAP通路的新靶基因FHL3。研究发现FHL3在肝细胞癌组织中高表达且与患者不良预后相关，并通过一系列体内外实验证实了FHL3促进肝细胞癌进展的分子机制。

研究人员主要运用了自发水动力转染小鼠模型、蛋白质组学分析、免疫共沉淀(Co-IP)、染色质免疫沉淀(ChIP)、NanoBiT蛋白质相互作用检测、分子对接等技术，并利用TCGA和GEO数据库进行生物信息学验证。研究队列包括50对新鲜冻存肝细胞癌组织样本和110对石蜡包埋组织样本。

FHL3是肝细胞癌中YAP诱导的异常表达基因

研究人员首先构建了c-MYC/AKT/Vector或c-MYC/AKT/YAP驱动的自发肝细胞癌模型，通过转录组测序筛选出14个与YAP最相关的差异基因。经过进一步验证，确定FHL3是YAP最相关的靶基因。Western blot和免疫组化结果证实YAP/c-MYC/AKT组中FHL3表达显著升高。

FHL3在肝细胞癌中高表达且与不良预后相关

TCGA和GEO数据库分析显示，FHL3 mRNA在肝细胞癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。在50对Tongji队列样本中，RT-qPCR和Western blot结果一致表明FHL3在肿瘤组织中高表达。免疫组化显示FHL3主要定位于细胞核，在肿瘤组织中表达升高。生存分析显示FHL3高表达患者总体生存期(OS)和无病生存期(DFS)更差，多因素Cox回归分析证实FHL3是肝细胞癌患者的独立预后危险因素。

FHL3促进肝细胞癌细胞体外增殖、侵袭和迁移

研究人员在7种肝细胞癌细胞系中检测FHL3表达水平，选择低内源性表达的Hep3B和Huh7细胞构建FHL3过表达细胞系，高内源性表达的MHCC97H和HLF细胞构建FHL3稳定敲低细胞系。CCK-8实验和EdU掺入实验表明FHL3过表达显著促进细胞增殖，而FHL3敲低则抑制增殖。Transwell和小室实验结果显示FHL3过表达增强肝细胞癌细胞的侵袭和迁移能力。

FHL3在体内促进肿瘤生长和肺转移

裸鼠皮下异种移植实验显示，FHL3过表达组肿瘤体积和重量显著增加，而FHL3敲低组肿瘤生长受到抑制。Ki67免疫组化染色表明FHL3过表达组增殖细胞比例更高。肝脏原位移植模型进一步证实FHL3促进肿瘤生长，肺组织H&E染色显示FHL3高表达组肺转移结节数量更多。

FHL3与MAZ相互作用

通过免疫共沉淀联合质谱分析，研究人员筛选出84个与FHL3特异性结合的候选蛋白，其中MAZ作为经典的DNA结合转录因子引起关注。外源性和内源性IP实验验证了FHL3与MAZ的相互作用，NanoBiT蛋白质相互作用检测和免疫荧光实验进一步证实了两者在细胞核内的共定位。结构域分析表明FHL3通过其LIM4结构域与MAZ的锌指结构域结合，缺失LIM4结构域会显著影响FHL3与MAZ的相互作用。

FHL3通过影响MAZ与G4s的结合调控转录活性

基因集富集分析(GSEA)显示FHL3高表达组中KRAS信号通路显著富集。CUT&Tag分析发现FHL3敲低影响MAZ与KRAS启动子区域的结合。RT-qPCR和Western blot结果表明FHL3或MAZ过表达均可上调KRAS mRNA和蛋白水平，并激活下游ERK、PI3K-AKT和STAT3信号通路。临床样本免疫组化显示FHL3与KRAS表达呈正相关，两者共高表达患者预后最差。

分子机制研究表明，FHL3和MAZ均能结合KRAS启动子的G4s结构区域。分子对接实验显示FHL3的LIM4结构域和MAZ的锌指结构与特殊的G4s结构相互作用，其中FHL3的Phe263残基对其与G4s的结合至关重要。FHL3敲低会破坏G4s结构的稳定性，从而影响MAZ介导的转录调控。

FHL3通过KRAS信号通路促进肝细胞癌进展

挽救实验证实，在FHL3过表达基础上敲低KRAS，可显著减弱FHL3对肝细胞癌细胞增殖、侵袭和迁移的促进作用。同样，在FHL3敲低基础上过表达KRAS，可逆转FHL3敲低对细胞恶性表型的抑制。体内实验进一步验证KRAS是介导FHL3促进肝细胞癌进展的关键下游分子。

FHL3敲低显著抑制Hippo-YAP信号通路对肝细胞癌的促进作用

研究发现YAP可上调FHL3 mRNA和蛋白表达水平。荧光素酶报告基因实验和ChIP实验证实YAP/TEAD通过结合FHL3启动子区-1143至-510区段的TEAD结合位点调控FHL3转录。临床数据分析显示YAP与FHL3表达呈正相关，两者共高表达患者预后最差。功能实验表明FHL3敲低可显著抑制YAP过表达对肝细胞癌细胞增殖、侵袭和转移的促进作用。自发肿瘤模型证实FHL3敲低可延缓YAP/c-MYC/AKT诱导的肝细胞癌进展。

YAP和KRAS在肝细胞癌中具有相似的表达特征和预后

TCGA数据库分析和临床样本验证均显示YAP与KRAS表达呈正相关，两者共高表达患者预后最差。Western blot结果表明YAP通过FHL3-MAZ轴上调KRAS表达并激活其下游信号通路。

本研究首次揭示了Hippo-YAP信号通路通过转录调控FHL3表达促进肝细胞癌进展的新机制。FHL3作为YAP的下游靶基因，通过其LIM4结构域与转录因子MAZ相互作用，稳定KRAS启动子区的G4s结构，招募MAZ激活KRAS转录，进而驱动肝细胞癌的恶性进展。这一发现不仅深化了对Hippo-YAP信号通路在肝细胞癌中作用机制的理解，而且为Hippo通路异常激活的肝细胞癌患者提供了潜在的诊断标志物和治疗靶点。针对FHL3-MAZ-KRAS轴的干预策略可能成为肝细胞癌治疗的新方向，特别是对于YAP高活性的肝细胞癌患者具有重要的临床转化价值。