基于低共熔溶剂的双水相系统在下游加工中提取生物制药的创新研究

《Journal of Chromatography A》：Aqueous biphasic systems based on deep eutectic solvents for extraction of biopharmaceuticals in downstream processing

本研究针对生物制药下游加工成本高、能耗大的痛点，创新性地开发了基于低共熔溶剂(DES)的双水相系统(ABS)。研究人员通过构建四烷基铵盐与氯化胆碱组成的DES体系，成功实现了对单克隆抗体(mAb)替代物γ-球蛋白的高效提取，并在磷酸盐缓冲液(PBS)中对利妥昔单抗(RTX)的提取效率达到87.0%以上。该技术突破为生物制药纯化提供了可持续的替代方案，显著降低生产成本和环境负担。

　　

随着全球生物制药市场的迅猛发展，单克隆抗体(mAb)作为主导治疗药物，在2024年已占据约4520亿美元的市场份额。然而，下游加工环节却成为制约行业发展的瓶颈，占据总生产成本50-80%的比例。传统的Protein A亲和色谱法虽然选择性高，但其昂贵的成本、苛刻的洗脱条件(pH 3.0-4.0)以及抗体不稳定性等问题，严重限制了规模化应用。与此同时，溶剂使用在生物制药生产中贡献了近60%的能耗，这使得开发新型可持续纯化技术迫在眉睫。

在这一背景下，来自葡萄牙波尔图大学的研究团队在《Journal of Chromatography A》上发表了一项创新研究，他们探索了基于低共熔溶剂(DES)的双水相系统(ABS)在生物制药提取中的应用潜力。这种新型提取技术有望同时解决成本效益和环境可持续性两大挑战。

研究人员采用的主要技术方法包括：通过核磁共振(¹H NMR)表征DES的化学结构和纯度，利用浊点滴定法构建双水相系统的相图，通过紫外-可见光谱(UV-vis)评估蛋白质稳定性，并建立了一套完整的提取效率评估体系。特别值得注意的是，研究还采用了AGREEprep绿色分析指标对方法的环保性进行量化评估。

3.1. DES制备与表征

研究团队成功制备了多种四烷基铵盐基DES，其中[N₄₄₄₄⁺][Cl^?]:3[EG]（四丁基氯化铵:乙二醇=1:3）、[N₄₄₄₄⁺][Cl^?]:3[Gly]等体系表现出良好的稳定性和均一性。通过系统的筛选，最终确定了四种适合用于ABS的DES配方，为后续提取研究奠定了基础。

3.2. 双液相相图分析

相图研究揭示了不同DES体系与磷酸盐形成双水相的能力差异。研究发现，随着烷基链长度的增加，DES的疏水性增强，更易形成双水相系统。其中[N₄₄₄₄⁺][Br^?]:2[EG]体系表现出最优的相形成能力，这为后续提取条件优化提供了重要依据。

3.3. 免疫球蛋白在DES中的稳定性

通过UV-vis光谱分析发现，γ-球蛋白在DES浓度高达80% (v/v)的条件下仍能保持结构完整性，未出现明显的蛋白质聚集或构象变化。这一发现证实了DES在生物制药提取中的生物相容性，为其实际应用提供了安全性保障。

3.4. 基于DES的双水相系统提取研究

初期实验发现，在高离子强度条件下γ-球蛋白易发生聚集，导致提取效率计算出现偏差。通过优化提取条件，特别是采用K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲体系(pH 7.0)并降低搅拌强度，成功实现了95.2%的提取效率，且蛋白质构象得到良好保持。

3.5. 单克隆抗体RTX的应用研究

在实际应用层面，研究团队成功将DES-ABS技术应用于治疗性单克隆抗体利妥昔单抗(RTX)的提取。在最佳条件下，[N₄₄₄₄⁺][Cl^?]:3[Gly]体系对RTX的提取效率达到99.5%，即使在细胞培养基复杂环境中仍能保持86.0%的提取效率，证明了该技术在实际生产环境中的适用性。

3.6. 绿色性评估

通过AGREEprep指标评估显示，该DES-ABS方法的综合绿色得分为0.69，显著高于传统Protein A色谱法的0.40。特别是在废物产生、能耗和试剂毒性等方面表现出明显优势，体现了其在绿色可持续生产方面的巨大潜力。

这项研究的创新之处在于首次系统地将DES-ABS技术应用于大分子治疗性蛋白质的提取纯化，成功解决了传统方法面临的高成本、高能耗问题。研究不仅证实了该技术在实验室条件下的可行性，还通过细胞培养基环境的验证，展示了其工业化应用的潜力。更重要的是，该技术为生物制药行业提供了一条符合绿色化学原则的可持续发展路径，有望在未来推动整个行业向更加环保、经济的方向转型。

随着生物制药市场的持续扩张，这种新型提取技术有望成为下游加工领域的重要突破，为单克隆抗体等生物大分子的规模化生产提供技术支撑。未来研究可进一步探索DES体系的优化设计、提取过程的连续化操作以及溶剂回收利用等方向，推动该技术向产业化应用迈进。